子痫前期患者血脂水平及脂蛋白脂酶基因多态性相关性研究

汤琳琳，徐友娣，薛鑫源

(南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)妇产科，江苏南京 210006)

子痫前期(preeclampsia，PE)是孕20周后发生的，以高血压、蛋白尿为主要特征的多脏器损害性疾病。该病严重影响母婴健康，是孕产妇和围生儿病率及死亡率升高的主要原因之一，其发病机制至今尚未完全阐明，各家学说不一，可能与遗传易感性、免疫适应不良、胎盘缺血和氧化应激反应有关。目前国内外大部分研究认为其发病起源于胎盘病理生理改变，进一步导致全身血管内皮细胞损伤，后者引起PE的一系列临床症状。血管内皮细胞损伤是PE一系列病理生理改变的基础。

研究表明，人体脂质代谢异常与PE密切相关。脂蛋白脂酶(LPL)与血脂代谢密切相关。而LPL基因决定了LPL的表达，推测LPL基因多态性亦与血脂代谢及PE存在着一定的相关性。本研究通过血脂测定，从全血中提取DNA，采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术检测实验组与对照组孕妇在LPL基因HindⅢ和PvuⅡ两个酶切位点的多态性及其对血脂水平的影响，并探讨PE的发生与LPL基因多态性之间的关系，为今后进一步研究PE的发病机理奠定基础，也为今后临床上的预防、早期诊断、干预性治疗和寻找药物作用靶点阐明机理。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验组按乐杰主编《妇产科学》第7版［1］标准，选取2007年7月至2010年8月在南京医科大学附属南京医院产科住院的确诊为PE的孕妇142例;对照组选取2007年7月至2010年8月在南京医科大学附属南京医院产科住院的157例年龄、孕周与实验组均无统计学差异的正常孕妇。所有孕妇均无其它合并症和慢性病史，如糖尿病、肾病综合征等。

1.2 实验方法

1.2.1 一般指标、血脂测定及24 h尿蛋白定量测定取研究对象空腹静脉血送医院OLYMPUS全自动生化分析仪进行血常规、肝功能及血脂等检测，并记录研究对象一般情况及检测结果。收集24 h尿液贮存于容器内，全部送检，采用免疫比浊法进行24 h尿蛋白定量测定。检测前要先用量杯量取总尿量后搅匀，取其中100 ml测蛋白量，再根据实际尿量进行计算。

1.2.2 DNA提取 取全血3 ml，选用美国OMEGA公司提供的全血DNA试剂盒，提取基因组DNA后置-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 PCR 所有引物购自上海英骏生物技术有限公司。限制性内切酶HindⅢ对应LPL基因内含子8区所需PCR引物参照Wang等［2］合成:上游引物为5'-GAT GTC ACC TGG ATA ATC AAA G-3';下游引物为5'-CTT CAGCTA GACATT GCT AG-3';内含子6区所需PCR引物参照Mead等［3］合成:上游引物为5'-ATG GCA CCC ATG TGT AAG GTG-3';下游引物为5'-GTG AAC TTC TGA TAA CAA TCT C-3'。PCR总反应体系50 μl，组成如下:PCR Master Mix(2 ×)25 μl，上游引物1.0 μl，下游引物1.0 μl，模板 DNA 3.0 μl，灭菌水20μl。混匀后按下列循环扩增:94℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸90 s，72 ℃保温延伸10 min，共35个循环，最后 72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳，出现特异性条带。限制性内切酶HindⅢ对应条带为365 bp，PvuⅡ对应条带为440 bp。

1.2.4 RFLP LPL基因内含子8区及6区PCR产物分别与限制性内切酶HindⅢ、PvuⅡ混合，水浴37℃过夜。成分如下:PCR产物 10μl，HindⅢ或 PvuⅡ1.0 μl，10×buffer R 2.0 μl，灭菌双蒸馏水 17 μl。取各自酶切产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳30 min，溴化乙锭染色后凝胶成像系统成像分析。LPL基因内含子8区PCR扩增产物为365 bp，经HindⅢ限制性内切酶水解后可得到3种基因型，含HindⅢ酶切位点的等位基因记为“H+”，无酶切位点记为“H-”，即H+H+型，终产物为205、160 bp的2个条带;H+H-型，终产物为365、205、160 bp 3个条带;H-H-型，终产物为365 bp的1个条带。LPL基因内含子6区PCR扩增产物为440 bp，经PvuⅡ限制酶水解后可得到3种基因型，含PvuⅡ酶切位点的等位基因记为“P+”，无酶切位点的记为“P-”，即P+P+型，终产物为330、110 bp的2个条带;P+P-型，终产物为440、330、110 bp的 3个条带;P-P-型，终产物为440 bp的1个条带(图1)。

M为Marker;u、v为P+P+基因型条带;r、l为P+P-基因型条带

M为Marker;c、a为H+H+基因型条带;e为H+H-基因型条带

图1 PCR-RFLP技术检测结果

1.3 统计学处理

研究对象血脂水平及HindⅢ和PvuⅡ限制性内切酶酶切结果均经SPSS 13.0统计软件分析，血脂水平用均数±标准差表示，比较用t检验;两组基因型分布频率及等位基因表型频率的比较均采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料比较

实验组和对照组组间的年龄、孕周构成差异无统计学意义。实验组均为晚发型子痫前期患者，包括轻重两型。两组的收缩压和舒张压均有明显差异，有统计学意义(P＜0.01)。实验组24 h尿蛋白定量为(4.69±1.74)g。实验组总蛋白、白蛋白及血红蛋白均比对照组低，差异有统计学意义(P＜0.01);两组间丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及血小板计数差异无统计学意义(P＞0.05)(表1)。

表1 实验组及对照组的基本资料

2.2 实验组与对照组血脂水平比较

实验组甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及载脂蛋白B(ApoB)均明显高于对照组(P＜0.01)，低密度脂蛋白(LDL)亦高于对照组(P＜0.05)，差异均有统计学意义;高密度脂蛋白(HDL)低于对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)，其中的脂质成分LP(a)高于对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05);载脂蛋白A1(ApoA1)低于对照组(P＜0.01)，差异有统计学意义。实验组动脉粥样硬化指数［(TC-HDL)/HDL，AI］较对照组显著升高(P＜0.01)(表2)。

表2 实验组与对照组血脂水平比较

2.3 LPL基因HindⅢ和PvuⅡ酶切多态性

LPL基因HindⅢ酶切位点H+H+、H+H-、HH-基因型，实验组分别为 117(82.4%)、19(13.4%)、6(4.2%);对照组分别为 108(68.8%)、36(22.9%)、13(8.3%)。实验组等位基因 H+253(89.1%)、H-31(10.9%);对照组等位基因 H+252(80.3%)、H-62(19.7%)。基因型及等位基因分布频率组间比较P值均小于0.05(基因型P=0.024，等位基因P=0.003)，差异有统计学意义。LPL基因PvuⅡ酶切位点P+P+、P+P-、P-P-基因型，实验组分别为 74(52.1%)、39(27.5%)、29(20.4%);对照组分别为 78(49.7%)、43(27.4%)、36(22.9%)。实验组等位基因P+187(65.8%)、P-97(34.2%);对照组等位基因 P+199(63.4%)、P-115(36.6%)。基因型及等位基因分布频率组间比较P值均大于0.05(基因型P=0.86，等位基因P=0.528)，差异无统计学意义。见表3、4。

2.4 LPL基因多态性与血脂水平的关系

LPL-HindⅢ实验组和对照组各基因型之间血脂水平差异显著，H+H+基因型的 TC、TG、LDL、ApoB及AI明显高于另两种基因型(P＜0.01)，HDL及ApoA1低于另两种基因型(P＜0.01)，Lp(a)无明显差异(P＞0.05)。实验组和对照组LPL-PvuⅡ各基因型间血脂水平差异均无统计学意义(P＞0.05)(表5、6)。

3 讨 论

PE高血脂病理学理论认为，血管的抗毒活性降低引起了内皮细胞毒性及TG在细胞内堆积，在PE症状出现前，孕5～20周时血中游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)已经升高，高浓度FFA可增加胰岛素抵抗、内皮细胞功能损伤及改变血管活性物质产生［4］。本研究

结果显示实验组TG、TC及ApoB均明显高于对照组(P＜0.01)，LDL亦高于对照组(P＜0.05)，差异均有统计学意义;HDL低于对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05)，其中的脂质成分LP(a)高于对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05);ApoA1明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。实验组AI较对照组显著升高(P＜0.01)，具有动脉粥样硬化高风险。这与多数研究结果［5-9］相一致，进一步证实了PE患者存在脂质代谢紊乱。

表3 实验组与对照组LPL-HindⅢ基因多态性统计结果

表4 实验组与对照组LPL-PvuⅡ的基因多态性统计结果

表5 LPL基因HindⅢ多态性与血脂水平的关系

表6 LPL基因PvuⅡ多态性与血脂水平的关系

LPL是一种糖蛋白，主要由脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等合成和分泌，其主要生理功能是分解脂蛋白核心成分TG，是血浆中清除TG的限速酶，可以催化乳糜微粒(chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)核心中的 TG水解，以供组织氧化供能和储存需要，同时，它还参与VLDL及HDL中载脂蛋白和磷脂之间的转换，影响HDL和LDL的成熟。LPL基因位于第8号染色体短臂P22区，长约30 kb，由10个外显子和9个内含子组成。LPL基因第8内含子HindⅢ位点多态性是由碱基G→T互换引起，根据有无HindⅢ内切酶位点分别将两个等位基因称为H+和H-等位基因。研究表明，LPL基因第8内含子HindⅢ位点多态性对血脂水平有明显的影响。Long等［10］发现高脂血症组H+等位基因频率明显高于血脂正常组，且在高脂血症组中H+H+基因型表现有更高的血浆TG、ApoB100、TG/HDLC，血脂正常组中H+H+基因型有更高的血浆TG和HDL-C3c。H+H+基因型的血浆TG水平显著升高，而HDL-C水平显著降低［11-12］;携带H+等位基因个体较H-个体具有较高的 TG 水平［13］。杨志明等［14］对哈萨克族人LPL基因HindⅢ、S447X多态性与代谢综合征(metabolic syndrome，MS)及其组分(腰围、收缩压、舒张压、TG、HDL-C、空腹血糖)关系的研究表明，与对照组相比，MS组H+H-/H-H-基因型、H-等位基因频率明显低。随着MS组异常的增多，H+H+携带率有相应增加趋势。本研究结果与国内外文献相似，表明实验组和对照组LPL-HindⅢ各基因型之间血脂水平差异显著，H+H+基因型的TC、TG、LDL、ApoB及AI明显高于另两种基因型(P＜0.01)，HDL及ApoA1低于另两种基因型(P＜0.01)，Lp(a)无明显差异(P＞0.05)。实验组 LPL基因H+H+基因型及H+等位基因的携带率均较对照组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。表明LPL基因HindⅢ酶切位点多态性与PE的发生存在一定相关性，携带H+等位基因的孕妇可能更易发展成为PE。

LPL的PvuⅡ酶切位点在内含子6区，是由一个C→T碱基置换引起，目前相关研究结果不一致。国外Chamberlain等［15-16］发现P+P+基因型者血清TG水平显著高于其它基因型者，而国内樊芸等［17］认为P+等位基因与血浆HDL的下降没有关联，尽管P+P+基因型者的血清HDL水平较P+P-基因型者和PP-基因型者有增高的趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。崔晓栋等［18］通过对78名2型糖尿病患者和49名正常对照个体比较发现，虽然病例组P+P+基因型HDL低于P-P-组(P=0.013)，但两组TG、TC相比并无明显差别。李建新等［19］研究发现P+P+基因型可引起血浆TG升高、HDL降低;妊高征组和对照组不同基因型间血浆TG、LDL差异无统计学意义。本研究表明实验组和对照组LPL-PvuⅡ各基因型间血脂水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。LPL基因PvuⅡ酶切位点基因型(P+P+，P+P-，PP-)及等位基因(P+，P-)分布频率在实验组与对照组之间差异无统计学意义(基因型P=0.86，等位基因P=0.528)。

LPL基因HindⅢ和PvuⅡ酶切位点均位于内含子区，它们所导致的基因变异并不会直接影响LPL活性，推测H+H+基因型可能通过连锁不平衡作用或通过与个体血脂水平以及动脉粥样硬化发生发展密切相关的ApoE等其他基因的协同作用影响血浆LPL活性，从而调节脂质代谢，影响LPL对CM和VLDL-C中TG的脂解作用，进而形成异常脂质血症，进一步引起血管内皮损伤等一系列病理生理改变而引起PE的发生。而PvuⅡ酶切位点的多态性可能并不参与影响LPL的活性，抑或其影响很小。分析LPL基因HindⅢ酶切位点多态性，对检测PE高危人群，预测、预防及早期发现PE有非常重要的意义。

目前，国内外的研究在LPL基因HindⅢ酶切多态性与血脂水平及PE的关系上具有较强的一致性。而PvuⅡ酶切位点多态性与血脂水平及PE的关系研究有较大的差异，考虑可能与人群、种族、地域或样本量有关，或是某些基因虽未发生突变，但其基因活性的改变也可能与发病相关，同时PE是一种多因素疾病，属遗传易感性疾病，是遗传因素与环境因素共同作用的结果。探求PE的发病原因以及将研究成果应用于临床以筛选PE的高危人群，还需要更大规模的、多方面的、多地域的、多民族的流行病学和进一步的实验室研究加以证实。

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