炭疽菌附着胞形成的影响因素及形态特征比较

陈玉森，叶乃兴，许文耀，刘 威，魏日凤，刘 伟

(1.福建农林大学植物保护学院;2.福建农林大学茶叶科技与经济研究所;3.福建农林大学园艺学院，福建福州350002;4.宁德师范学院，福建宁德352100)

炭疽菌(Colletotrichum Corda)是一类重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范围广泛，严重危害多种瓜果、蔬菜、林木及药材等.该属已被描述的种超过1000个，但不同学者的划分标准不同.von Arx［1－3］以形态学特征为主要依据划分种;Sutton［4］主张加入纯培养学特征;Mordue［5－6］则提出以形态学、培养学、生理学、病理学及地理分布等综合指标划分种;von Arx et al［7］和Kendrick［8］强调全型(holomorph)真菌概念，认为种的划分应建立在有性态和无性态的联系上，种级鉴定标准应以分生孢子和附着胞形态为主、培养特性为辅、寄主范围作参考的综合特征来确定［9］.附着胞是炭疽菌产生的能穿透寄主组织的特殊侵染结构［10］，其形态特征既然作为种划分的依据之一，就有必要了解影响其稳定的因素.据报道，孢子悬浮液pH、水的硬度、葡萄糖和乙烯浓度会影响炭疽菌附着胞的生长发育［11－14］，其他因素则未明确.因此，本文研究孢子龄、叶汁种类和孢子悬液浓度对炭疽菌孢子萌发、附着胞形成及形态的影响，为探明不同菌株附着胞发育过程中的差异及了解其作为物种鉴定的适用范围奠定基础.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从福州、泉州等地的茉莉、香蕉、番石榴、大豆等22种作物上分离获得22个炭疽病原菌株，经鉴定［12－25］确认后，将各菌株保存在4－8℃冰箱内，使用时移入外加4 g·L－1KNO3的PSA培养基平板上培养产孢.

1.2 孢子萌发形成附着胞过程观测

用寄主为茉莉的菌龄5 d的炭疽菌孢子，配成4.2×105个·mL－1孢子水悬液，在凹玻片上滴60 μL孢子悬液，置于皿底垫有湿润滤纸的培养皿内，放在25℃光照培养箱中，经12、24、48、72、96 h后分别观测附着胞大小并统计附着胞率.

1.3 活体寄主上和用寄主汁诱导产生的附着胞形态特征观测

将寄主为杧果的炭疽菌孢子用水和杧果汁配成3.4×105个·mL－1孢子悬液.各取60 μL，孢子水悬浮液滴于成熟完好的杧果表面上，孢子果汁悬浮液滴于凹玻片上，25℃、光照下保湿培养12 h，观察活体寄主上和用寄主汁诱导产生的附着胞形态特征，测量其大小.果汁制法:杧果25 g，水1000 mL，沸煮30 min后过滤去渣，经高压灭菌后使用.

1.4 不同菌龄孢子萌发及附着胞观测

将寄主为茉莉的炭疽菌在培养基上培养，再将菌龄达5、7、9、11、13、15、17 d的孢子，分别用水和茉莉叶汁配成1.7×105个·mL－1孢子悬液，按1.2方法，观测并统计25℃下光照12 h后的孢子萌发率和附着胞率.叶汁制法:茉莉叶片200 g，水1000 mL，沸煮30 min后过滤去渣，经高压灭菌后使用.

1.5 不同种类叶汁孢子悬液附着胞形态特征观测

采集杧果、番石榴、茶树、白菜、枇杷、刺桐、豇豆、烟草、柑橘、甜瓜、桃树、花生、大豆、红麻及葡萄的叶片，按1.4方法制成叶汁.将寄主为大豆的炭疽菌在培养基上培养6 d，用以上15种叶汁及水分别配成3.4×105个·mL－1孢子悬液，按1.2方法，观测并统计25℃下光照12 h后的附着胞形状和大小、孢子萌发率、附着胞率.

1.6 不同菌株不同浓度孢子悬液中的孢子萌发及附着胞观测

将胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)6个菌株以及壳皮炭疽菌(C.crassipes)、芸薹炭疽菌(C.higgisianum)、黑线炭疽菌(C.dematium)、豆类炭疽菌(C.truncatum)、毁灭炭疽菌(C.destructivum)各 1 个菌株［12－20］，分别用培养基培养6 d，各菌株孢子用水分别配成 3.4 ×107、3.4 ×106、3.4 ×105、3.4 ×104和 3.4×103个·mL－1等5个梯度悬液.按1.2方法，观测并统计25℃下光照12 h后各菌株孢子萌发率和附着胞率.

1.7 不同菌株附着胞形态特征观测

将胶孢炭疽菌12个菌株以及辣椒炭疽菌(C.capsici)、壳皮炭疽菌、芸薹炭疽菌、黑线炭疽菌、豆类炭疽菌、毛豆炭疽菌(C.boninense)、瓜类炭疽菌(C.orbiculare)、葡萄刺盘孢菌(C.ampelinum)、芭蕉炭疽菌(C.musae)和毁灭炭疽菌各1个菌株［12－25］，分别用培养基培养6 d，各菌株孢子分别用水配成3.4×105个·mL－1孢子悬液.按1.2方法，观测25℃下光照12 h后的附着胞形态特征.

上述6个试验所用的水均为无菌水，pH 6.8，每个处理重复3次.

2 结果与分析

2.1 寄生于茉莉的炭疽菌孢子萌发和附着胞形成规律

结果(图1、表1)表明，孢子在水中萌发产生芽管后，不断长出分枝，后形成卵形、梨形、姜瓣形等暗褐色的附着胞，胞内分布黑色颗粒状物，边缘光滑.该菌孢子常形成1个附着胞，但随水培时间延长，单个孢子可逐渐形成多个附着胞，96 h后可见单个孢子产生7个附着胞且有继续增长的趋势，但附着胞大小均无明显差异.

图1 单个孢子产生7个附着胞(400×)Fig.1 Seven appressoria generated from a single spore(400 ×)

表1 寄生于茉莉的炭疽菌孢子形成附着胞的规律Table 1 Appressorium formation regulation of C.gloeosporioides from Arabian jasmine

2.2 炭疽菌在寄主上与用寄主汁诱导产生的附着胞形态差异

炭疽菌在活体寄主上与用寄主汁诱导产生的附着胞形态存在一定差异.寄生于杧果的炭疽菌孢子悬液滴于杧果表面，其发育的附着胞为卵形、梨形、姜瓣形，暗褐色、灰色，长 ×宽为5.7－11.4(7.9)μm ×5.9－7.5(5.6)μm;用果汁配的孢子悬液，在凹玻片上离体培育，其诱导产生的附着胞为梨形、卵形、姜瓣形，褐色，长 × 宽为8.4－14.9(9.7)μm ×5.9－8.1(7.2)μm.

2.3 菌龄和寄主叶汁对寄生于茉莉的炭疽菌孢子萌发及附着胞形成的影响

由表2看出，寄生于茉莉的炭疽菌孢子在水中的萌发率相对较低，且随菌龄增大而快速下降;附着胞率则均大于81%，且随菌龄增大而上升.菌龄5 d的孢子悬液萌发率达51.7%，附着孢率81.8%，适合于附着孢形态的观察.

表2 菌龄和寄主叶汁对孢子萌发率及附着胞形成率的影响1)Table 2 Effects of spore age and host leaves juice on spore germination rate and appressorium formation rate of C.gloeosporioides

炭疽菌孢子在茉莉叶汁中的萌发率相对较高;但附着孢率明显低于水培，菌龄5－7 d的孢子萌发后未形成附着胞，虽然随菌龄增大附着胞率上升，但17 d的附着胞率也仅55.0%.这说明营养虽能促进孢子萌发，但抑制了附着胞的形成，不适合作为附着孢形态观察的介质.这可能与是否需要附着胞作为病菌侵染工具有关，叶汁中的丰富营养物质可供孢子吸收萌发、菌丝分枝生长，不需要附着胞建立侵染点.

2.4 不同植物叶汁对寄生于大豆的炭疽菌孢子萌发和附着胞形态特征的影响

结果(图2、表3)表明，与水培相比，白菜、枇杷、花生、甜瓜、豇豆、杧果、桃树、刺桐及柑橘等9种植物叶汁均能与大豆叶汁一样促进寄生于大豆的炭疽菌孢子萌发，同时不同程度地抑制附着胞形成;茶、番石榴、烟草、葡萄等4种植物叶汁对孢子萌发和附着胞形成有显著抑制作用，致使孢子不萌发或萌发后芽管畸形，不产生附着胞.经生物学统计，寄生于大豆的炭疽菌孢子萌发率与附着胞率相关系数r=0.5311，说明二者间相关性不显著.观测还表明，寄生于大豆的炭疽菌在缺乏营养物质的水中形成的附着胞，形态稳定，大小均匀，主要为梨形、卵形，暗褐色，长 × 宽为 7.4－9.9(8.6)μm ×5.3－6.4(5.6)μm.在大豆、白菜等10种供试植物叶汁中该菌附着胞个体相对较大且大小不均一，部分附着胞形态发生变异，出现半椭圆形、姜瓣形等，大豆汁、杧果汁诱发的附着胞较水培颜色浅，为淡褐色(表3).综合上述试验结果，用菌龄5 d的孢子水培诱发附着孢，萌发率、附着孢率适中，形态稳定，适合于炭疽菌种的比较鉴定.

图2 寄主大豆的炭疽菌附着胞形态(400×)Fig.2 Appressorium morphology of C.truncatum(400 × )

表3 不同植物叶汁对寄生于大豆的炭疽菌附着胞形态特征的影响1)Table 3 Effects of some plant juices on morphological characteristics of C.truncatum

2.5 不同菌株不同孢子悬液浓度对孢子萌发和附着胞形成的影响

表4显示，悬液浓度高时炭疽菌孢子不萌发或仅极个别萌发，附着胞率低，甚至为0;随悬液浓度降低，孢子萌发率均有不同程度的上升，附着胞率则在悬液浓度为3.4×106个·mL－1时出现一个峰值后下降;悬液浓度低时虽然孢子萌发率很高，但附着胞率极低.综合来看，观测附着胞形态特征的孢子悬液浓度应以3.4 ×105个·mL－1左右为宜.

表4 不同菌株不同孢子悬液浓度对孢子萌发和附着胞形成的影响1)Table 4 Effects of spore concentrations on conidium germination and appressorium formation

2.6 22株炭疽菌附着胞形态特征比较

由表5看出，12个胶孢炭疽菌株中，寄主为茉莉、油茶等的11个菌株的附着孢形状类型和色泽基本相同，在一个视野内可见梨形、卵形或姜瓣形等附着胞;各菌株附着胞大小相似;未成熟的附着胞为无色或灰色，成熟时则为暗褐色.这些菌株单凭附着胞形态难以被区别开来.寄生于雷公藤的炭疽菌附着胞形状类型较多，胞内灰色颗粒物明显，周边粗齿状，黑褐色，相对容易识别.其他10个菌株产生的附着胞形状多样，有姜瓣形、球形、不规则形、梨形及卵形等，色泽类型也较多，有灰色、褐色、黑色等，胞内颗粒物凸出或无，与孢子形态相结合，能将菌株初步区别开来.

表5 22株炭疽菌附着胞形态特征Table 5 Appressorium morphological characteristics of Colletotrichum species from 22 hosts

3 结论与讨论

5 d菌龄的孢子以水配成3.4×105个·mL－1左右的孢子悬液，在25℃光照下培养12 h，附着胞的形态特征稳定，该条件较适宜孢子萌发与附着孢的观察.用该方法诱导22株炭疽菌产生附着孢，对其形态特征观察发现，11种炭疽菌产生的附着胞形态特征存在一定的差异，与孢子形态相结合，能将这些菌株初步区分出来;胶孢炭疽菌的12个菌株中，除寄生于雷公藤的炭疽菌外，其余11个菌株的附着孢形态差异不明显，单凭肉眼观察难以区别.Crouch et al［26－27］指出，胶孢炭疽菌复合类群下包括许多具有明显系统发育分化及生理病理特征分化的不同物种，仅根据形态和寄主，已经不足以准确鉴定种.Damm et al［28］认为，物种鉴定必须是基于基因型与表型相结合的更为完整而科学的物种概念.因此，附着胞形态差异只能作为种间鉴定的依据之一，通过观察不同寄主的炭疽菌附着胞形态更有助于理解其病理特征的分化.

［1］von ARX J A.Die arten der guttung Colletotrichum Corda［J］.Phytopathol Z，1957，29:413－468.

［2］von ARX J A.The Fungi Aporulating in Pure Culture［M］.Lehre，New York:J Cramer，1970:288－290.

［3］von ARX J A.A Revision of Fungi Classified as Gloeosporium［M］.2d ed.Lehre，New York:J Cramer，S-H Service Agency，1970:170－180.

［4］SUTTON B C.The Coelomycetes:Fungi Imperfecti with Pycinidia，Acervuli and Stromata［M］.London:Commonwealth Mycological Institute，1980:523－537.

［5］MORDUE J E M.Colletotrichum graminicola［M］.London:CMI Description of Pathogenic Fungi and Bacteria，1967:131－145.

［6］MORDUE J E M.Colletotrichum lindemuthianum［M］.London:CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria，1971:280－292.

［7］von ARX J A，WEIJMAN A C M.Conidiation and carbohydrate composition in some Candida and Torulopsis［J］.Antonie van Leeuwenhoek，1979，45:547－555.

［8］KENDRICK W B.The Whole Fungus［M］.Ottowa:National Museums of Canada Ottowa，1979:241－264.

［9］吴文平，张志铭.炭疽菌属(Colletotrichum Cda.)分类学研究Ⅰ.属级分类和名称［J］.河北农业大学学报，1994，17(2):24－30.

［10］王洪凯，林福呈，王政逸.植物病原真菌附着胞的机械穿透力［J］.菌物学报，2004，23(1):151－157.

［11］孙辉，游春平.炭疽菌与寄主植物的互作研究［J］.安徽农业科学，2010，38(4):2022－2024.

［12］谢旭阳，欧阳秩.柑桔炭疽菌分生孢子萌发及附着胞形成条件的研究［J］.西南农业大学学报，1991，13(1):99－102.

［13］张敬泽，胡东维.影响柿树炭疽菌孢子萌发、附着胞形成及致病性的环境因子［J］.植物病理学报，2004，34(2):154－161.

［14］王葵娣，王文华，郑服丛.炭疽菌附着胞的研究进展［J］.中国农学通报，2007，23(1):265－270.

［15］邓欣，谭济才.湖南茉莉病害调查［J］.湖南农业科学，1991(5):42－45，47.

［16］陆家云.植物病原真菌学［M］.北京:中国农业出版社，2004:455－458.

［17］靳爱仙，周国英，李河.油茶炭疽病的研究现状、问题与方向［J］.中国森林病虫，2009，28(2):27－31.

［18］陆家云.植物病害诊断［M］.2版.北京:中国农业出版社，1997:181－186.

［19］贾玉，郑翠梅，张广民，等.山东省主产烟区烟草炭疽病菌的鉴定与分子检测［J］.山东农业科学，2012，44(4):10－14.

［20］陈百文，刘伟，叶乃兴，等.对茶树炭疽病菌具拮抗作用的茶树内生细菌的筛选［J］.福建农林大学学报:自然科学版，2007，39(4):341－346.

［21］江茂生，许文耀.艾蒿提取物对13种植物病原菌物的抑制作用［J］.福建农林大学学报:自然科学版，2007，36(4):352－356.

［22］范晓龙，朱建华，周旭，等.南方红豆杉炭疽病病原鉴定及其生物学特性［J］.福建林学院学报，2006，26(2):117－122.

［23］黄思良，霍秀娟，韦刚.芒果炭疽病菌，Colletotrichum gloeosporioides的生物学特性［J］.西南农业大学学报，1999，12(2):83－88.

［24］李梅婷，张绍升.香蕉内生炭疽菌鉴定及致病性测定［J］.亚热带农业研究，2008，4(2):128－131.

［25］吴翠萍，周明，王达龙，等.南京地区入境水果真菌病害调查［J］.植物检疫，2003，17(2):111－112.

［26］CROUCH J A，CLARKE B B，WHITE J F，et al.Systematic analysis of the falcate-spored graminicolous Colletotrichum and a description of six new species of the fungus from warm season grasses［J］.Mycologia，2009，101:717－732.

［27］CROUCH J A，CLARKE B B，HILLMAN B I.What is the value of ITS sequence data in Colletotrichum systematics and species diagnosis.A case study using the falcate-spored，graminicolous Colletotrichum group［J］.Mycologia，2009，101:648－656.

［28］DAMM U，WOUDENBERG J H C，CANNON P F，et al.Colletotrichum species with curved conidia from herbaceous hosts［J］.Fungal Diversity，2009，39:45－87.