两种多孔生物玻璃支架材料的体外细胞相容性研究

2013-12-23章燕蒋欣泉张秀丽王德平甄蕾

华西口腔医学杂志 2013年3期

关键词：支架

章燕　蒋欣泉　张秀丽　王德平　甄蕾

[摘要] 目的对比研究采用同样原料但以不同方法制备的两种多孔生物玻璃支架材料的体外细胞相容性。方法溶胶-凝胶法制备A/W生物活性微晶玻璃（4006材料），熔融法制备多孔生物活性玻璃（45S5材料）。体外诱导分离培养及鉴定兔骨髓基质细胞（BMSCs），通过材料浸提液细胞毒性实验（MTT法）、细胞黏附实验、倒置相差显微镜、扫描

电镜和环境扫描电镜比较4006材料和45S5材料对BMSCs细胞黏附和生长的影响，并探索与材料复合的最佳BMSCs细胞悬液浓度。结果 4006材料浸提液培养1 d时，其细胞活力与纯培养液间无统计学差异（P>0.05）；但培养3 d后，

其细胞活力低于纯培养液（P<0.01）。45S5材料浸提液培养的细胞活力明显低于纯培养液（P<0.01）。细胞与材料复合培养后，镜下见BMSCs在4006材料孔隙内贴壁生长良好，分泌基质活跃；而在45S5材料上细胞黏附生长较差。BMSCs与4006材料的黏附量随接种细胞浓度升高而升高，细胞悬液浓度为2×107 个·mL-1时的细胞黏附量最高。结论溶胶-凝胶法制备的A/W生物活性微晶玻璃具有良好的生物活性和细胞相容性，具有作为骨组织工程支架材料的潜能。与其复合的细胞悬液浓度需要2×107 个·mL-1或以上。

[关键词] 骨组织工程；支架；生物活性微晶玻璃；溶胶-凝胶法；骨髓基质细胞；细胞相容性

[中图分类号] R 318.08 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.019

随着组织工程学的发展，利用种子细胞和支架材料复合构建组织工程骨的方法，为骨缺损修复提供了一个崭新的思路。种子细胞培养与支架材料研制是组织工程学的两大核心环节。含有磷灰石（apa-

tite）和硅灰石（wollastonite）微晶相的生物陶瓷材料被命名为A/W生物活性微晶玻璃（apatite/wollastonite bioactive glass-ceramic，A/W BGC），这种材料在保持了良好生物活性的同时，其力学性能也接近于自然骨[1]。A/W BGC的制备及其作为骨组织工程中细

胞支架材料的研究，目前国内外尚处于起步阶段[2-3]。

A/W BGC中基础玻璃的制备方法包括传统的熔融法和新的溶胶-凝胶法两种，其中溶胶-凝胶法得到的生物玻璃具有更大的比表面积，能够为含碳羟磷灰石的形成提供更多的Si-OH成核位置点，提高微晶玻璃的生物活性，且溶胶-凝胶法制备的生物玻璃中的Ca2+比熔融法制备的更容易溶解[4]。溶胶-凝胶法制备的A/W BGC是否更适合组织工程的要求，目前尚无定论。

本研究通过体外实验对比研究原料同组分的溶胶-凝胶法制备的A/W BGC玻璃和传统熔融法制备的多孔生物活性玻璃的细胞相容性。从材料浸提液细胞毒性、材料与细胞的复合、倒置相差显微镜、扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）和环境扫描电镜（environmental scanning electron micros-cope，ESEM）观察等方面，评价两种多孔生物玻璃

支架材料的细胞相容性，预测其作为骨组织工程支架材料的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物、材料及设备

3月龄新西兰实验兔1只，体质量2.1 kg，雌性，健康，无骨骼系统及内分泌系统疾病（普通级实验

动物，上海交通大学医学院动物中心提供）。

戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司

进口分装），肝素钠注射液（常州千红生化制药有限公司），DMEM（Gibco-BRL公司，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、维生素C（Hyclone公司，美国），胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、地塞米松、β-磷酸甘油钠、青霉素、链霉素、MTT粉（Sigma公司，

美国），碱性磷酸酶试剂盒（上海放射免疫分析技术研究有限公司）。

恒温二氧化碳细胞培养箱（Hera公司，德国），

倒置相差显微镜及照相系统（SS-325型，Tomy公司，日本），酶联免疫分析仪（BP800型，Bioht公司，芬

兰），环境扫描电镜（QUANTA-200型，Philips公司，荷兰）。

1.2 多孔生物材料的制备与检测

由同济大学材料学院用同样组分[MgCO3、CaCO3、NH3·H2O、SiO2、C2H5OH、Ca（H2PO4）2·H2O、CaF2、

Ca（NO3）2·4H2O、Mg（NO3）2·6H2O、HCl等]的原料，采用溶胶-凝胶法制备新型多孔A/W BGC（4006材

料），孔隙率为70%以上，开口气孔率超过60%，孔径200～500 μm；采用传统熔融法制备多孔生物活性玻璃（45S5材料），孔隙率为70%，孔径250～500 μm。

制备成底面6 mm×6 mm、厚度4 mm的立方状，高温高压消毒后备用。

1.3 兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，

BMSCs）的体外诱导分离培养及鉴定

将配制好的3%戊巴比妥钠液（30～40 mg·kg-1）从兔一侧的耳缘静脉无菌操作下注射进行麻醉。麻醉完全后在无菌条件下抽取新鲜骨髓2 mL，用选择培养基进行体外诱导培养、分离、纯化、扩增。以Von Kossa染色、细胞碱性磷酸酶活性检测方法对分离纯化的细胞进行成骨性能鉴定[5]，得到一定数量、有成

骨潜能的BMSCs作为种子细胞。收集细胞后，配制成以下密度的细胞悬液：0.2×104、0.4×104、0.6×104、0.8×104、1.0×104、1.2×104、1.4×104、1.6×104、1.8×104、2.0×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106个·mL-1，每种密度接种8孔进行培养，并用MTT法绘制细胞密度-吸光度标准曲线。将实验中分离培养得到并已经验证

有成骨性的兔BMSCs传代培养至第3～5代用于以下

实验。

1.4 材料浸提液细胞毒性实验

将同样规格大小的两种支架材料（4006、45S5）

计算表面积后，按3 cm2·mL-1的比例使用条件培养液浸泡，37 ℃下浸提2 d，得到浸提液。取材料浸提液与条件培养液按比例配成100%（即纯材料浸提液）、50%、25%、12.5%、6.25%、0%（即纯条件培养液）的溶液。

将BMSCs用胰酶消化后，制成5×105 个·mL-1浓度的细胞悬液，接种入96孔板的72孔中，培养24 h，待细胞稳定贴壁生长后进行下一步实验。用含不同

浓度浸提液的培养液替代96孔板中原纯条件培养液进行细胞培养，每种浓度各培养6孔细胞。培养的第1、3天，每种浓度取3孔，MTT法测定各孔的吸光度（D490），取均数。另测未放入细胞的纯材料浸提液（即空白浸提液）、未放入细胞的纯条件培养液（即空白培养液）的吸光度值作为校正用。将纯材料浸提液、纯条件培养液培养细胞得到的吸光度值，减去相应空白浸提液和空白培养液的吸光度，得到校正值，用校正值进行分析。

1.5 最佳复合浓度筛选试验

在24孔板中分别放入已用条件培养液预湿过24 h的4006材料和45S5材料，每种材料各12孔。预先制备好BMSCs细胞悬液，使其终密度分别为2×104、2×105、2×106、2×107 个·mL-1。用可调手动移液器将细胞悬液以每次10 μL的量，逐次滴加到材料上，直至材料饱和而没有含细胞的培养液流出为止，每种浓度每种材料接种3孔。置于37 ℃、5%CO2及100%饱和湿度的培养箱中，待细胞稳定黏附6 h后再加入培养液，使材料完全被浸没，用量大约为每孔1.0 mL，隔日换液。每日在倒置相差显微镜下观察细胞与材料的黏附情况。

在复合第3天细胞已稳定贴壁黏附后，将复合有细胞的材料取出，移入另一48孔板的24孔中，加入条件培养液每孔500 μL。MTT法测量两种材料上已黏附细胞的活力（吸光度）。具体操作如下。1）向已放入复合有细胞材料的24孔中，加入MTT液每孔50 μL，37 ℃、5%CO2及100%饱和湿度的培养箱中继续培养，让MTT液与材料上复合的细胞作用4 h。吸去培养液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，

DMSO）每孔375 μL。在微型振荡器上振荡10 min。2）将48孔板放入酶标仪，在490 nm的光波下测定细胞吸光度（D490）。每组3份样本，计算均数。3）将48孔板中测得的吸光度减去相应材料空白浸提液的吸光度，得到校正吸光度。对照1.3中所得到的细胞浓度-吸光度标准曲线，估算材料上细胞黏附的量。

1.6 BMSCs与生物材料复合后观察

根据最佳复合浓度筛选试验的结果，选用2×

107 个·mL-1浓度的细胞悬液以同样方法分别接种预湿好的4006材料、45S5材料。逐日使用倒置相差显微镜观察细胞生长及与支架材料的附着情况。在材料与细胞复合培养的第4、7天，进行SEM和ESEM检查，观察细胞在材料表面的附着生长情况。

2 结果

2.1 细胞浓度-吸光度标准曲线

MTT法绘制的细胞浓度-吸光度标准曲线见图1。

细胞的吸光度随着细胞浓度增加而增加。

图 1 细胞浓度-吸光度标准曲线

Fig 1 Standard curve of cell density to the absorbance

2.2 材料浸提液细胞毒性实验

纯材料浸提液和纯条件培养液培养细胞1、3 d时的吸光度见表1、2。4006材料浸提液培养1 d时，其细胞活力与纯培养液间无统计学差异（P>0.05）；

但培养3 d后，其细胞活力低于纯培养液（P<0.01）。

45S5材料浸提液培养1、3 d时，其细胞活力均低于纯培养液（P<0.01）。

MTT检测结果表明：4006材料与45S5材料培养细胞的吸光度随浸提液用量的减少而升高，0%浸提液组（即纯培养液）培养细胞的吸光度均为各组中最高（图2）。

2.3 最佳复合浓度筛选试验

不同浓度细胞悬液接种后黏附细胞的MTT结果见表3。从表3可见，4006材料上黏附细胞活力的吸光度随接种细胞悬液浓度的升高而升高，即BMSCs与4006材料的黏附量随接种细胞浓度的升高而升高。45S5材料上黏附细胞的吸光度随接种细胞浓度变化不大。两种材料之间相比较，2×106 个·mL-1和

2×107 个·mL-1浓度时其细胞黏附率差异具有统计学意义，4006材料的细胞黏附率明显高于45S5材料（P<0.01）。同种材料内相比较时，2×106 个·mL-1、2×107 个·mL-1浓度时的细胞黏附率与其他浓度间的差异均有统计学意义，2×107 个·mL-1浓度时的细胞黏附量最高（P<0.01）。4006材料在2×107 个·mL-1浓度

时，黏附细胞的吸光度为0.653 330±0.052 624，对照细胞浓度-吸光度标准曲线，对应的细胞浓度约为4×104 个·mL-1。这说明材料上有效细胞黏附量还是相对较低。

2.4 BMSCs与生物材料复合后观察

2.4.1 倒置相差显微镜观察 BMSCs与4006材料复合3 d后，材料周围散落的未黏附细胞在培养皿底部贴壁生长良好（图3左）；BMSCs与45S5材料复合3 d

后，材料溶解不规则，周围培养皿底未见贴壁生长活细胞，仅见大量散在黑色物质，为规则晶体样物质（图3右），推测为材料降解析出的晶体。

2.4.2 SEM观察 BMSCs与4006材料复合4 d后，细胞黏附于4006材料表面增殖生长，材料的自然孔隙中可见细胞长入（图4左），7 d时细胞数量明显增多，生长情况良好，细胞分泌基质活跃。BMSCs与45S5材料复合后，未见明显的细胞形态，仅见少量的纤维样物质附着于材料表面，但可见活化磷灰石样晶体（图4右）。

3 讨论

3.1 支架材料

应用于骨组织工程的无机材料主要是生物陶瓷类，生物活性微晶玻璃也称为生物活性玻璃陶瓷，其结构、性能和制备方法与玻璃和陶瓷都有所不同，但在性能上集中了二者的共同优点。Hench等[6]发明了部分降解含磷和钙的硅玻璃，其中一类具有特殊结构，称为生物活性玻璃（bioactive glass，BG）。其表面部分在水溶液中可形成富含氧化硅和钙、磷离子的胶样层，有利于羟磷灰石的形成和沉积，然后羟磷灰石晶体可吸附胶原黏多糖和糖蛋白，从而在BG与骨和软组织之间形成一层无机-有机界面，这种化学结合方式非常强烈而稳定，有利于新生骨组织在BG表面直接形成。

A/W BGC的制备分为基础玻璃的制备和热处理加工两步。基础玻璃的制备包括熔融法和溶胶-凝胶法两种。溶胶-凝胶法与熔融法相比，具有较高的化学均匀性、较低的反应温度、可控的颗粒尺寸和形状、方便制膜和涂层、更均一的相分布等特点。溶胶-凝胶法制备生物材料时，由于溶剂的挥发等原因，还会在生物材料颗粒中生成大量的5～100 nm的微孔，其表面积是熔融法制备的同种材料的上万倍，更大的比表面能够为含碳羟磷灰石的形成提供更多的Si-OH成核位置点，提高微晶玻璃的生物活性，同时使Ca2+的溶解更加容易，这与其具有更高的化学活性和更加开放的结构有关[5]。

3.2 生物玻璃材料浸提液的细胞毒性

组织工程要求生物材料不仅要具有良好的机械强度和代谢性能，更要具有良好的生物相容性，利于细胞的黏附、生长和分化。本研究对溶胶-凝胶法制备的4006材料和传统熔融法制备的45S5材料的细胞相容性进行分析，结果表明，不同浓度的4006材料浸提液培养细胞的吸光度（D490）随浸提液用量的减少而升高，45S5材料浸提液中却没有类似规律性变化。研究同时表明，不同浓度的4006材料和45S5材料浸提液所培养细胞的吸光度均小于纯条件培养液（即0%浸提液组）所培养细胞的吸光度，说明材料浸提液与纯培养液相比仍有一定差异。培养1 d时，4006材料浸提液与纯培养液相比，其细胞毒性无统计学差异。培养3 d后，吸光度低于纯培养液组（P<

0.01）。说明在培养3 d时，4006材料浸提液所培养细胞的活力低于纯培养液组，这可能与4006材料浸提液内细胞增殖速度比纯培养液组中的细胞慢有关。4006材料浸提液可能对细胞的增殖有一定的影响。纯45S5材料浸提液培养1 d和3 d时，细胞吸光度均低于纯培养液组（P<0.01）。说明与培养液相比，45S5

材料的浸提液有一定的细胞毒性。溶胶-凝胶法制备的4006材料的浸提液细胞毒性低于以熔融法制备的45S5材料。

3.3 最适接种细胞浓度

细胞与材料的相互作用是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的黏附是基础，细胞必须与材料发生适当的黏附，才能进行迁移、分化和增殖。由于每种生物材料与细胞的黏附力不同，最适接种的细胞浓度也不相同。本研究采用不同浓度的细胞悬液接种材料，观察对比细胞复合效果，从而选择最适接种的细胞浓度为下一步组织工程骨构建实验作准备。

目前关于与各种材料复合的细胞浓度众说纷纭，细胞悬液浓度1×104～5×107 个·mL-1不等。阎俏梅等[7]对BMSCs经诱导、扩增后与冻干脱矿骨基质体外附着的规律研究发现：其黏附率随接种细胞数量的增多而提高，但当黏附率提高到一定程度时，增加接种细胞量黏附不再增加反而有所下降。当接种密度为1.0×106 个·cm-2时，细胞与冻干脱矿骨之间有最大附着量。根据既往文献报道所曾提及的细胞浓度，本实验选用了2×104、2×105、2×106、2×107 个·mL-1共4个数量级浓度的细胞悬液，按同样体积接种4006材料和45S5材料，通过检测材料上细胞黏附率，来筛选该支架材料的最适接种细胞浓度的数量级。研究结果显示：4006材料的细胞黏附率高于45S5材料，且4006材料上黏附细胞活力的吸光度随接种细胞悬液浓度的升高而升高，2×107 个·mL-1细胞悬液与4006材料的附着率最高。45S5材料上黏附细胞的吸光度随接种细胞浓度变化不大。建议在进一步的组织工程骨构建实验中，使用2×107 个·mL-1或以上浓度的细胞悬液与材料进行复合。但对照标准细胞浓度-吸光度曲线，发现材料上有效细胞黏附量还是相对较低，尚待进一步提高细胞黏附率。

3.4 BMSCs与生物玻璃材料复合的情况

为了解BMSCs与生物玻璃材料复合的情况，本研究采用倒置相差显微镜、SEM和ESEM进行观察。倒置相差显微镜下可见4006材料皿底细胞生长良好，形态正常，说明4006材料旁细胞可正常生长，其细胞毒性较小。结合SEM和ESEM观察结果，BMSCs与4006材料可以良好的黏附，表现出分泌基质的生物学行为。由此说明，4006材料具有良好的细胞相容性。45S5材料皿底未见到正常生活细胞，溶液中可见材料析出的规则晶体。结合电镜和SEM结果，45S5材料在镜下只表现出活化的磷灰石晶体貌，基本没有细胞的黏附。说明45S5材料细胞毒性较大，无论材料上还是溶液中，细胞都不能存活。此结果也可解释最佳复合浓度筛选试验中，45S5材料组吸光度明显低于4006材料组和培养液对照组，不随着接种细胞浓度变化而变化。由此可以得出结论：4006材料具有良好的细胞相容性，其作为支架材料的性能优于45S5材料，但其与市场上其他种类支架材料的性能比较还需要进一步的实验研究。

本研究结果表明：溶胶-凝胶法制备的A/W BGC比同组分熔融法制备的多孔生物活性玻璃具有更好的细胞相容性，具有作为组织工程骨支架材料的潜能。本实验中以A/W BGC作为支架材料，与细胞进行复合，效果最佳的是2×107 个·mL-1浓度的细胞悬液。在后续组织工程骨构建实验中，建议使用2×107 个·mL-1或以上浓度的细胞悬液。

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