效应面法优化活血消瘿片中挥发油的包合工艺

胡俊杰，肖伊，王桂红，郑国华 （.湖北中医药大学，湖北 武汉430065；.孝感市孝南区食品药品监督管理局，湖北孝感43000）

活血消瘿片是根据湖北中医药大学附属医院陈如泉教授的临床经验方，自主研发而成的中药复方制剂，具有活血通络、消瘿化结之功效，临床上主要用于治疗结节性甲状腺肿［1］。处方由桃仁、莪术、柴胡等8味中药组成，其中，莪术、柴胡均含有挥发油，且是主要活性成分［2－4］。为将该制剂开发成现代中成药，减少挥发油损失，增加其在制剂生产和贮存过程中的稳定性，保证药效，本研究利用β－环糊精对挥发油进行包合。

目前，国内数理统计往往采用正交设计或均匀设计［5］，寻求最佳的因素水平组合，但不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而无法找到整个区域上的因素的最佳组合和响应的最优值。Box－Behnken效应面法是统计设计试验技术的合成，利用Box－Behnken 的试验设计并通过试验得到一定数据，采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法［6］。本实验采用采用单因素试验结合Box－Behnken效应面法优选活血消瘿片中挥发油的最佳包合工艺条件。

1 材料

Mettler－Toledo AG285 型 分 析 天 平（Mettler－ToledoGmbH，Laboratory ＆ Weighing Technologies，Switzerland）；无水乙醇为分析纯，水为自制重蒸水；β－环糊精（国药集团化学试剂有限公司，批号F20100614）；挥发油提取制备工艺：按处方比例取莪术、柴胡两味药材，补足其1倍吸水量后，加入8倍量的水浸泡3h，运用中国药典2010年版一部附录XD 方法提取挥发油6h，用无水乙醇萃取，取乙醇层用无水硫酸钠干燥过夜，滤去无水硫酸钠，挥去乙醇，得挥发油备用。处方中各药材购自湖北天济中药饮片有限公司，经湖北中医药大学生药教研室陈科力教授鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 评价指标 筛选指标：包合率。

挥发油的包合率＝包合物中实际含油量（mL）／［挥发油投入量（mL）×空白回收率］×100%

挥发油空白回收率＝收集挥发油的量／加入挥发油的量×100%

挥发油空白回收率测定：精密量取挥发油1.0 mL置于500mL圆底烧瓶中，加入纯化水250mL，按中国药典2010年版一部附录挥发油测定法甲法［5］测定挥发油量，经3次测定，计算空白回收率为95%。

2.2 包合方法的选择［8］通过预试验和结合文献，本实验主要对饱和水溶液法和超声法进行比较研究。

2.2.1 饱和水溶液法 取1mL挥发油，用4mL无水乙醇溶解。称取6gβ－环糊精，置150mL具塞锥形瓶中，加100mL的纯化水，水浴加热使溶解，自然冷却至50℃，置控温磁力搅拌器上边搅拌边滴加挥发油乙醇溶液，加塞继续搅拌1h，平行操作3次。

2.2.2 超声法 取1mL 挥发油，用4mL 无水乙醇溶解。称取6gβ－环糊精，置150mL具塞锥形瓶中，加100mL的纯化水，水浴加热使溶解，自然冷却至50 ℃，置50kHz超声清洗仪中边超声边滴加挥发油乙醇溶液，加塞继续超声1h，平行操作3次。

2.2.3 包合物的制备及挥发油的测定 分别将上述2种方法制得的包合物溶液置冰箱中，冷藏12h，抽滤，少量水洗，抽至近干，再无水乙醇洗涤至无挥发油气味，干燥，即得β－环糊精 包合物。将制得的包合物置于500 mL 圆底烧瓶中，加入纯化水250 mL，测定挥发油量。

2.2.4 包合方法的选择试验结果 采用超声法和饱和水溶液法包合工艺所得的挥发油平均包合率分别为57.05%和63.16%。饱和水溶液法的包合效果较好，因此采用饱和水溶液法进行包合。

2.3 单因素试验初步优化饱和水溶液法包合工艺

2.3.1 β－环糊精加入量对包合工艺的影响 固定包合温度为50 ℃，包合时间为1h，以挥发油－β－环糊精（mL∶g）的量对挥发油包合率的影响进行单因素试验。设计挥发油－β－环糊精（mL∶g）为1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，结果见图1。

图1 β－环糊精加入量对包合工艺的影响（n＝3）Fig 1 Effects ofβ－CD addition amount on inclusion process（n＝3）

由图1可知，挥发油－β－环糊精在1∶2～1∶6之间时，随着β－环糊精加入量的增加，挥发油包合率增加显著；当挥发油－β－环糊精（mL∶g）为1∶6时挥发油包合率达到最高值，后期趋于平缓。因此，选择挥发油－β－环糊精（mL∶g）在1∶4～1∶8之间。

2.3.2 包合时间对包合工艺的影响 固定挥发油－β－环糊精（mL∶g）为1∶6，包合温度为50 ℃，以包合时间对挥发油包合率的影响进行单因素试验。设计包合时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，结果见图2。

图2 包合时间对包合工艺的影响（n＝3）Fig 2 Effects of inclusion time on inclusion process（n＝3）

由图2可知，随着包合时间的延长，挥发油包合率提高，包合时间为2h时，包合率达到最高值。再延长包合时间，包合率有下降趋势。因此，包合时间应在1.5～2.5h之间。

2.3.3 包合温度对包合工艺的影响 固定挥发油－β－环糊精（mL∶g）为1∶6，包合时间为2h，以包合温度对挥发油包合率的影响进行单因素试验。设计包合温度分别为30，40，50，60，70 ℃，结果见图3。

图3 包合温度对包合工艺的影响（n＝3）Fig 3 Effects of inclusion temperature on inclusion process（n＝3）

由图3可知，随着包合温度的升高，在30～50℃之间，挥发油包合率显著提高，包合温度为50 ℃时，包合率达到最高值。再升高包合温度，包合率反而下降。这可能是因为包合温度的不断升高，使部分挥发油挥发，从而使包合率下降。因此，包合温度应在40～50 ℃之间。

2.4 响应面法优化挥发油的包合工艺［11－13］

2.4.1 响应面分析 采用软件Design Excerpt 7.0.0中的Box－Behnken 试验设计原理，综合单因素试验结果，设计三因素三水平试验设计表1。三因素分别是挥发油－β－环糊精（mL∶g）（A）、包合时间（B）、包合温度（C）。

表1 Box－Behnken试验设计因素和水平Tab 1 Factors and levels of Box－Behnken design test

2.4.2 响应面法优化挥发油的包合工艺 以A、B、C为自变量，挥发油包合率Y 为响应值（%），响应面分析方案及结果见表2。

2.4.3 模型的建立及显著性检验 用ANOVA 分析响应面的回归参数。由表3可知，A、A2、B2、C2项达到极显著水平（P＜0.01）。C、AB 项达到显著水平（P＜0.05）。

利用Design－Expert软件对表2数据进行多元回归拟合，得到挥发油包合率对挥发油－β－环糊精（A）、包合时间（B）和包合温度（C）的二次多项回归模型：

表2 响应面分析方案及结果Tab 2 Results of response surface analysis programme

式中，——Y 为挥发油包合率（%），A为挥发油－β－环糊精（g∶mL），B为包合时间（h），C为包合温度（℃）。

该方程的相关系数R＝0.985 1。由表3方差分析结果可知，整体模型P＜0.01，方程模型达到极显著，失拟项P＞0.05，不显著，因此二次模型成立，应用此方程可以预测挥发油的包合率及优化饱和水溶液法包合挥发油工艺。

表3 响应面二次回归方程方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis of response surface quadratic regression equation

2.5 包合工艺的响应面分析与优化 用Design－Expert软件，根据回归方程分析作响应面图4～6，图4显示在包合温度50 ℃条件下，包合率随挥发油－β－环糊精和包合时间的增加先迅速增大后缓慢减小，由此可见适当的增大挥发油－β－环糊精和包合时间，可以一定程度的提高包合率。图5显示在包合时间2h条件下，包合率随包合温度的增大先增加后减小，包合率随挥发油－β－环糊精的增加先迅速增大后缓慢减小。图6显示在挥发油－β－环糊精为1∶6条件下，包合率随包合温度的增大先增加后减小，包合率随包合时间的增加先迅速增大后缓慢减小，因此，在实际生产中应慎重控制包合温度，以获得较高的包合率。

图4 挥发油－β－环糊精与包合时间对包合率影响的效应面Fig 4 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

图5 挥发油－β－环糊精与包合温度对包合率影响的效应面Fig 5 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion temperature on response value of volatile oil inclusion rate

图6 包合温度与包合时间对包合率影响的效应面Fig 6 Response surface plot for the effect of inclusion temperature and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

2.6 挥发油包合工艺条件 结合二次回归模型的数学分析结果，利用Design－Expert软件对二次回归方程求解，得最佳工艺条件为：挥发油－β－环糊精为1∶6.8，包合时间2.2h，包合温度46.95 ℃，在此条件下挥发油的包合率可达82.23%。考虑到试验操作的可行性，将包合工艺的最佳条件修正为：挥发油－β－环糊精为1∶6.8，包合时间2.2h，包合温度47℃，在此条件下进行3次验证试验。

验证试验结果表明，挥发油包合率基本稳定，包合率的均值（82.11%）与包合率的预测值（82.23%）的相对误差很小，证明包合工艺合理、可行。

3 讨论

本实验通过对超声法、饱和水溶液法2种包合方法进行比较研究，确定饱和水溶液法为较好的包合方法。然后采用单因素实验初步优化β－CD 加入量、包合时间、包合温度对包合工艺的影响，再用Box－Behnken响应面法优化挥发油的包合工艺，得出的最优饱和水溶液包合工艺条件为：挥发油－β－环糊精为1∶6.8，包合时间2.2h，包合温度47 ℃。挥发油的包合率为82.11%，包合率的均值（82.11%）与包合率的预测值（82.234%）的相对误差很小，证明包合工艺合理、可行。

目前，国内关于挥发油的包合工艺研究多采用正交设计、均匀设计试验，这些实验是建立在线性模型的基础上，只能对一个个孤立的实验点进行分析，实验精确度不高，预测性较差；而效应面法采用多元非线性拟合、二项式回归分析，囊括了实验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最佳组合条件等众多试验和统计技术，拟合预测能力优异可靠，该方法应用于挥发油包合工艺及中药制备工艺的优选，有较好的应用前景。

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