南方红豆杉内生真菌的分离鉴定及其细胞毒活性研究

张庆波 陈玉婵 李浩华 潘清灵 王磊 李冬利 陶美华 章卫民

（1. 广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室 广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，广州 510070；2. 中国科学院南海海洋研究所，广州 510301）

南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K）为红豆杉属（Taxus Linn）植物，主要分布于长江流域、南岭山脉山区及河南、陕西（秦岭）、甘肃等省。自红豆杉中发现具有独特抗癌机制的紫杉醇后，人们开始大量从红豆杉树皮中提取紫杉醇，致使红豆杉资源遭到严重破坏。为解决紫杉醇的新来源，人们采用了各种不同的方法，并取得了一定的成果。1991年，Christen等通过太平洋红豆杉（Taxus brevifolia）的组织培养获得了紫杉醇［1］；1994年，Nicolaou等［2］完成了紫杉醇的全合成。1993年，Stierle等［3］从太平洋红豆杉树皮内生真菌Taxomyces andreanae的发酵液中分离得到了紫杉醇，这一发现使红豆杉属植物中内生真菌及其次生代谢产物的研究成为热点，并发现许多内生真菌都能够产生紫杉醇或具有紫杉醇类似结构的代谢产物［47］。本研究对产自广东的南方红豆杉进行内生真菌的分离和鉴定，探讨南方红豆杉内生真菌的多样性，并对分离到的内生真菌的发酵粗提物进行体外细胞毒活性研究，旨在筛选出具有良好抗肿瘤活性的菌株，为进一步研究其活性次生代谢产物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

南方红豆杉样品，包括叶、枝条、果实及树皮，2008年10月采自广东省大东山自然保护区。

Taq酶及其他PCR相关试剂购于大连宝生物工程有限公司，其他分析纯化学试剂均为市售。

人神经胶质瘤细胞SF-268、人肺癌细胞NCIH460、人乳腺癌细胞MCF-7，均保存于广东省微生物研究所。

DMI 3000 B倒置显微镜（Leica）；S-3000 N扫描电镜（日立）；EPS 3501电泳仪（Amersham Pharmacia Biotech）； ImageQuant 350 凝胶成像仪；LAMBDA-E酶标仪（Biotech）；2123-2二氧化碳培养箱（Shellab）；Mastercycler gradient 5331 PCR仪（Eppendof）；RE-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；LRH-250生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；THZ-C-1摇床（广州市正一科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离 将采集的新鲜样品用流水冲洗，然后用无菌水漂洗2次，放入75%的乙醇中浸泡7 min，取出后用无菌水漂洗3次，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡5-7 min，取出后用无菌水漂洗4次。叶片用无菌剪刀剪去边缘后剪成约0.5 cm×0.5 cm 的方块；枝条用无菌手术刀削去四周，取中间部位剪成1 cm长的小段；树皮用手术刀去掉外皮层后，剪成0.5 cm×0.5 cm小块；果实剥去外皮，取中间部位，剪成小块。用最后一次漂洗用的无菌水涂板作为阴性对照。处理好的样品放入事先准备好的PDA平板（含20 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氨苄青霉素）培养基中，26℃恒温培养，待长出菌丝后，挑取平板中单一菌落进一步纯化，纯化后的菌株转接到装有PDA培养基的斜面上，4℃冰箱保存。

1.2.2 内生真菌的鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定 肉眼观察分离菌株在PDA平板上的培养特征；用光学显微镜观察菌丝、孢子、产孢结构等形态特征；用扫描电镜观察部分菌株的孢子、产孢结构等特征；参考《真菌鉴定手册》［8］，对分离菌株进行初步鉴定。

扫描电镜样品制备和观察：将PDA平板培养基上培养7-10 d的培养物连同培养基一起切成0.5 cm× 0.5 cm的小块，经3%戊二醛固定5 h，PBS缓冲盐洗涤；1%锇酸固定2 h，PBS缓冲盐洗涤；乙醇、丙酮脱水后，用乙酸异戊酯置换其中的溶剂（2次）。完全脱水后的样品临界点干燥3 h，喷金，扫描电镜观察。

1.2.2.2 分子鉴定 总DNA的制备参考王磊等［9］的方法。PCR扩增采用真菌rDNA内转录间隔区（rDNA ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，正向）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）［10］扩增分离菌株的rDNA ITS区。PCR采用20 μL反应体系，通过Ex Taq（TaKa-Ra）进行，反应条件为93℃预变性3 min；93℃变性45 s，55℃复性45 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。反应产物利用PCR产物纯化试剂盒（QIAGEN）纯化，纯化后的样品由广州景瑞生物科技有限公司进行测序。测序获得的序列通过BLAST 程序在GenBank上进行相似性序列检索分析。

1.2.3 细胞毒活性研究

1.2.3.1 发酵液提取物的制备 从斜面挑取少许菌丝接种到PDA平板上活化3 d，挑取活化后的菌丝（连同培养基）转接到装有500 mL PD培养基的1 L的三角瓶中，26℃，120 r/min的条件下摇床培养7 d。培养物抽滤后，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于40℃下减压浓缩至干，得到发酵液粗提物备用。

1.2.3.2 发酵粗提物的细胞毒活性测定 采用MTT法［11］测定发酵粗提物对肿瘤细胞SF-268、NCIH460和MCF-7的生长抑制率，各粗提物的作用浓度为100 μg/mL，以顺铂作为阳性对照，作用浓度为20 μg/mL，每处理重复3次。

2 结果

2.1 内生真菌的分离及鉴定

从南方红豆杉的叶、枝条、树皮及果实中共分离到内生真菌55株，根据培养特征将这些菌株分成32类，测序后获得22条不同的序列，将这些序列通过BLAST 程序在GenBank上进行序列相似性检索分析，结果见表1。

从表1可以看出，分离菌株中能确定种的有胶孢刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果球座菌（Guignardia mangiferae）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、暗色节菱孢（Arthrinium phaeospermum）和细交链孢菌（Alternaria alternata）；确定到属的有炭角菌属（Xylaria）、毛壳菌属（Chaetomium）、拟茎点霉属（Phomopsis）和长蠕孢属（Helminthosporium）；只能确定为植物内生真菌而未能确定其种属的有4株；而菌株A213、A220、A239和A241与最相似物种的相似率低，分别为92.1%、94.9%、93.1%和92.3%，有待作进一步鉴定。A213、A220、A239、A241的形态特征见图1及表2。

表 1 分离及测序结果

2.2 内生真菌的抗肿瘤活性

除了菌株A229和A232外，对其余20个菌株的发酵粗提物进行了体外细胞毒活性测试，结果见表3。从表3中可以看出，有4株内生真菌对神经胶质瘤细胞SF-268的抑制率在50%以上，有2株对肺癌细胞NCI-H460的抑制率在50%以上，有6株对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率在50%以上，其中菌株A223和A240对MCF-7的抑制率均在90%以上。

图1 菌株形态特征

表 2 菌株A213、A220、A239、A241的形态特征

表3 发酵粗提物细胞毒活性（作用浓度为100 μg/mL）

3 讨论

内生真菌在植物体内广泛分布，这种分布既有一定的宿主或组织专一性，又受宿主生长环境的影响，具有丰富的多样性。同一植物在不同的地理区域具有不同的内生真菌类群分布［12］。红豆杉的内生真菌多样性丰富，到目前为止已从红豆杉属植物中分离到不少不同种属的内生真菌（表4）。与已报道的南方红豆杉内生真菌比较，本研究首次从生长于广东地区的南方红豆杉中分离获得了以往未见报道的内生真菌，且菌株A213、A220、A239、A241与GenBank中最相似物种的相似率低，是否为新的种属有待进一步研究。可见，从不同地理区域的南方红豆杉中可以获得不同类群的内生真菌资源。

红豆杉内生真菌活性次级代谢产物的研究逐渐被人们所重视，已成为研究抗肿瘤药物和其他药物的重要资源。如从太平洋红豆杉植物内生真菌Taxomyces andreanae中分离得到的紫杉醇是一种活性很好的抗微管蛋白聚合的药物，已经被开发成为抗肿瘤药物应用于临床。此外，人们还从红豆杉属植物中分离到能够产生抗肿瘤活性物质的其他真菌。如王建锋［27］等从红豆杉皮层中分离到一株瘤座孢（Tubercularia sp.），发现其发酵液提取物在体外有较强的抗肿瘤活性；李桂玲［16］等从三尖杉、南方红豆杉及香榧中分离到172株植物内生真菌，利用MTT法对其进行活性检测表明，25株内生真菌对KB人口腔上皮癌或HL-60人白血病细胞具有显著的抑制作用。本研究对20株内生真菌发酵粗提物进行细胞毒活性研究，结果有6株对至少1种受试肿瘤细胞株的抑制率在50%以上，占受试菌株总数的30%，其中菌株A223和A240对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率在90%以上，值得对其活性次生代谢产物进行深入研究。

表4 部分南方红豆杉及其同属植物中的内生真菌

4 结论

本研究首次从南方红豆杉中分离获得了球座菌属、座腔菌属、炭角菌属、节菱孢属及长蠕孢属的内生真菌，丰富了南方红豆杉内生真菌的种类和数量；活性研究发现部分内生真菌的发酵粗提物具有良好的细胞毒活性。

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