高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备

王洪星 龚殿 孙玉娟 张雨良 王健华 刘志昕

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101）

甘蔗是最重要的糖料作物和最具潜力的能源作物，甘蔗栽培中大多以种茎作为繁殖材料和种质交流材料［1］，因此容易造成病毒病的逐代积累和远距离传播。世界上报道的甘蔗病毒病害有13种之多［2-4］，在甘蔗病毒病中流行范围最广，且对产量和品质影响最大的是甘蔗花叶病［5，6］。甘蔗花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）是引起甘蔗花叶病的一种重要病原，自然界中可由多种蚜虫以非持久方式传播，易机械接种，自然寄主仅限于禾本科植物，在自然条件下只危害高粱和甘蔗［7，8］。SrMV是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的成员［9］，编码346-350 kD蛋白质的单个开放阅读框，产物为一聚合蛋白，自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成10个成熟蛋白［10］。目前还未见SrMV CP基因的原核表达、抗血清制备的相关报道。本研究以SrMV-HN分离物染病植株总RNA为材料，采用RT-PCR方法克隆CP基因编码区，插入到pET32a原核表达载体，转化大肠杆菌表达宿主菌Rosetta（DE3），拟实现CP基因的原核表达，并制备高效特异性抗血清，旨在为建立SrMV检测体系进行田间样品检测打下了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗花叶病病样及原核表达载体pET-32a由本实验室保存。限制性内切酶、DNA分子量标记（DL2000）、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、PCR 回收试剂盒等均购自大连宝生物工程公司。E.coli DH5α、Rosetta（DE3）菌株由本实验室保存。透析袋购自Sigma公司。IPTG购自Promega公司。低分子量蛋白Marker购自Promega公司；BCIP/NBT底物显色试剂盒、丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均购自Solarbio公司；十二烷基磺酸钠（SDS）、甘氨酸、考马斯亮蓝R-250均购自Amresco公司；其他化学试剂均为国产分析纯。His-Tag单克隆抗体购自Novagen公司；Goat Anti-Mouse IgG（H&L）-AP购自北京康为世纪生物科技有限公司；其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产生化级或分析级试剂。

1.2 方法

1.2.1 重组原核表达载体pET32a-SrMV CP的构建根据SrMV相关基因序列（GenBank登录号：AJ310-197.1），基因位置：8424-9389。综合考虑酶切位点引物设计的各项原则，设计引物。SrMV-CP引物对所选取的酶切位点为EcoRⅠ和Hind III；所需寡核苷酸引物由上海生物工程公司合成。SrMV-CP引物序列［13］：

SrMV-CP-F：5'- GAAGAATTCGCAGGGGGCGGTACGGT-3'，其中下划线部分为EcoR I酶切位点，

SrMV-CP-R：5'- GCCAAGCTTTCAGTGGTGCTGTTGC-3'，其中下划线部分为 Hind III酶切位点。方框部分表示与模板相同或互补配对的序列。

以甘蔗花叶病病样的总cDNA为模板，SrMVCP-F和SrMV- CP-R为引物，进行PCR反应：94℃预变性3 min ；94℃变性30 s，55℃ 退火30 s ，72℃延伸1 min，35个循环；72℃终止补偿延伸10 min。取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的回收并纯化。PCR产物纯化采用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物技术有限公司），具体操作过程参照试剂说明书进行。回收PCR产物用T-A克隆方法克隆到质粒pMD 19-T simple vector（TaKaRa公司）中，转化到大肠杆菌DH5α。经菌液PCR和质粒双酶切（EcoR I/Hind III）鉴定后，阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序，获得目的基因重组克隆质粒pMD 19T-SrMVCP。

分别用EcoR I/Hind III 在37℃水浴中过夜双酶切重组克隆质粒pMD 19T-SrMVCP和表达载体pET32a（+），回收具有黏性末端的CP片段和pET32a（+），16℃水浴连接过夜，将回收的目的基因CP片段连接到pET32a（+）上，构建重组表达质粒。连接产物转化到大肠菌Rosetta（DE3）感受态细胞，经菌液PCR鉴定和EcoR I/Hind III质粒双酶切鉴定后，选择阳性单克隆测序，获得重组表达质粒pET32a-SrMVCP。

1.2.2 融合蛋白的诱导表达和可溶性分析 以1∶100的接种量，将转化进重组子pET32a-SrMVCP的大肠杆菌Rosetta（DE3），接种于50 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL）中，37℃摇床振荡培养。OD600值达到0.5-0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，转到30℃继续培养3-6 h。

取1 mL诱导表达的菌液加入2 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用50 μL双蒸水悬浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4℃条件下，12 000 r/min离心1 min，取上清10 μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色，分析融合蛋白的表达情况。收集经诱导培养4 h的菌液样品，采用超声波破碎菌体细胞，离心后分别取1 mL上清液和沉淀按上述方法进行SDS-PAGE电泳，对融合蛋白进行可溶性分析。

1.2.3 融合蛋白的纯化 扩大培养重组表达菌1 L，按上述条件诱导表达4 h。于4℃ 6 000 r/min离心30 min，菌体沉淀溶于50 mL Binding buffer中，冰浴放置30 min。经超声波破碎仪破碎细胞，冰浴放置30 min，4℃ 12 000×g离心30 min，上清过0.45 μm滤膜并通过Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次后，以6 mL Binding Buffer 平衡亲和柱。上柱后用6 mL Washing Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）洗脱杂蛋白，再以 6 mL Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，0.5 mol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脱融合蛋白。纯化后蛋白用透析袋经100 mL 1×PBS透析3次即为纯化蛋白。

1.2.4 抗血清制备及血清学检测 纯化的融合蛋白溶液经过透析袋透析获得溶于1×PBS的蛋白溶液。BCA法测定其浓度，与佐剂（1∶1）混匀，采用皮下多点注射抗原的方法免疫2只大白兔［10］，每只总注射量为2.0 mg，分3次免疫，每次间隔7-10 d，第3次免疫10 d后，每只白兔耳缘静脉取血0.5-1.0 mL，分离抗血清。以1×PBS的蛋白溶液作抗原，ID-ELISA检测抗血清效价，血清效价未符合要求则继续免疫。血清效价符合要求后，心脏采血，分离抗血清，抗血清效价和工作浓度分别以提纯的CP蛋白和感病的甘蔗叶片汁液为抗原进行IDELISA测定。

1.2.5 抗血清特异性鉴定 诱导表达后的菌体，进行SDS-PAGE凝胶电泳。用蒸馏水漂洗电泳后的凝胶，转入电转液中平衡10 min。利用电转膜方法，以100 V，60 mA转移1 h后，取出NC膜在蒸馏水中漂洗。将NC膜置于TBST缓冲液［20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20］配制的5%脱脂牛奶封闭液中4℃封闭过夜。封闭完成后，用TBST缓冲液漂洗NC膜后，将其转入按1∶1 000稀释的一抗TBST溶液，在37℃下，孵育40 min。取出NC膜，用TBST漂洗后，转入按1∶30 000稀释的碱性磷酸标记的山羊抗兔（IgG）TBST溶液中，37℃孵育40 min。取出NC膜，经TBST漂洗后，在NC膜蛋白面滴加含有330 μg/mL NBT（0.5 g NBT溶于10 mL 70%的二甲基甲酰胺中）和165 μg/mL BCIP（0.5 g BCIP溶于10 mL 100%的二甲基甲酰胺中）的显色液，直到条带清晰后，用蒸馏水漂洗两次，终止显色反应。取出NC膜晾干后进行扫描分析

1.2.6 田间样品检测 从海南各市县采集到25株疑似甘蔗花叶病样品进行ID-ELISA检测，健康组培苗作阴性对照，抗血清的工作浓度为1∶1 000；同时通过RT-PCR方法进行验证。

2 结果

2.1 CP基因克隆和表达质粒的构建

用PCR方法从病样总cDNA中扩增获得的CP基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳后，扩增片段大小约为987 bp（图1）。表达重组质粒pET32a-CP经EcoR I/Hind III双酶切验证，出现特异性DNA条带，其大小约为987 bp（图 2），从而进一步证明已成功构建了重组表达质粒pET32a-CP。

图1 PCR扩增产物

图 2 重组质粒pET32a-CP酶切鉴定

2.2 CP基因的诱导表达及可溶性分析

分别在37℃、25℃和IPTG终浓度0.1 mmol/mL条件下，诱导表达pET32a-CP重组表达菌Rosetta（DE3）。取1 mL菌液样品进行SDS-PAGE电泳分析，重组质粒表达量在Rosetta（DE3）菌（图 3-A）中远高于BL21（DE3）（图 3-B），因此采用在Rosetta（DE3）菌中表达。在Rosetta（DE3）菌中约53 kD处有一明显区别的条带，其大小与预估的融合蛋白大小符合。剩余菌液经细胞破碎仪破碎细胞后，分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳分析（图 4）融合蛋白的表达产物主要以可溶性的形式存在。同时对诱导条件的优化发现，IPTG终浓度0.1-1 mmol/L、诱导温度25-37℃、诱导时间1-6 h范围内，均可稳定表达；IPTG终浓度、诱导温度、诱导时间、不是其表达的决定因素。根据优化条件确立了CP基因表达的最佳条件：IPTG终浓度为0.1 mmol/L，诱导时间为4 h，诱导温度为30℃。

图3 pET32a-CP在不同宿主菌中表达产物的SDS-PAGE分析

图4 pET32a-CP重组菌表达产物的可溶性分析

2.3 融合蛋白的纯化

在30℃，IPTG终浓度0.1 mmol/mL条件下，对重组表达菌进行诱导培养4 h。获得的融合蛋白含有相对较多的可溶性蛋白，但同时也有一部分是包涵体蛋白。为了尽量保证融合蛋白CP的生物活性和简便操作过程，选择了上清进行可溶性蛋白纯化。Ni2+-NTA亲和层析纯化中，杂蛋白经100 mmol/L咪唑浓度的washing buffer洗脱后，与亲和层析柱Ni2+螯合的目的蛋白纯度已达要求。最终，用500 mmol/L咪唑浓度的washing buffer将融合蛋白溶于其中（图 5）。

图5 pET32a-CP重组菌表达产物SDS-PAGE检测及目的蛋白纯化

2.4 抗血清的制备和效价测定

图6 pET32a-CP重组菌表达产物的可溶性分析

在注射抗原蛋白到白兔前，用ID-ELISA对白兔进行免疫前血清本底水平检测，结果显示，试验所选用的家兔血清本底比较低，符合试验要求。将纯化获得的融合蛋白作为免疫原，第一次与完全佐剂等比例混匀，第2、3次与不完全佐剂等比例混匀，采用肌肉与皮下注射相结合免疫家兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液和感病的甘蔗叶片汁液为抗原进行ID-ELISA测定抗血清效价和工作浓度。结果（表1）表明，当以提纯的CP蛋白作抗原时，抗血清稀释104倍仍明显呈阳性反应；当以发病甘蔗叶片汁液为抗原时，抗血清在稀释103倍仍呈阳性反应，抗血清的工作浓度为1∶1 000。

表1 不同稀释度的抗血清与病样的ELISA结果的OD值

2.5 抗血清特异性鉴定

经Western blotting分析，结果（图 6）显示，兔抗CP抗血清仅与诱导表达菌SDS-PAGE凝胶53 kD条带处有反应，与其他条带均无反应。从而证明，抗血清能与纯化后融合蛋白起特异性反应。

2.6 田间样品检测

用所制备的抗血清进行了甘蔗花叶病样品检测，结果（表2）显示，该抗血清测得结果基本与PCR检测结果相符合，说明该抗血清较好的用于甘蔗组培苗的检测。

图 6 表达产物CP蛋白Western Blot检测

表2 甘蔗疑似样品ID-ELISA检测结果

3 讨论

制备高质量的抗血清对抗原的质量要求非常高，提取甘蔗中的SrMV病毒存在一定的困难。甘蔗体内含有较多的多糖和酚类物质，会影响病毒提纯的效率；病毒粒子提纯过程复杂繁琐，需要专门的大型仪器设备（如超、高速离心机，透射电镜），费时、费资、费力。这些大大限制了这类病毒的抗血清的制备。利用提纯的病毒制备的抗血清，由于提纯条件和纯化技术的客观限制，其中难免会含有某些寄主蛋白抗体，这很容易在后续的血清学反应中造成假阳性反应。而用改造好的工程菌来表达病毒的目的蛋白，得到的抗原量不但较多，而且其中不含寄主植物蛋白的成分，由此制备的抗血清会有较好的专化性，不容易出现假阳性。余乃通等［14，15］用香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白（NSP）、CP制得香蕉束顶病毒抗血清；李向东等［16］将SCMV-CP基因克隆到表达载体pET22b（+），Adv Virus Res，制备了专化性强、效价高的抗血清。

4 结论

本研究获得了高粱花叶病毒膜蛋白基因序列，用原核表达载体表达CP基因的全长蛋白，从而用pET32a（+）原核表达载体成功构建了CP基因表达质粒。在诱导表达中，表达量很高，且主要以可溶性蛋白存在。同时优化反应条件发现，IPTG终浓度、诱导温度、诱导时间，不是其表达的决定因素。本试验在低温条件下诱导表达，将获得的可溶性融合蛋白进行纯化，获得大量可溶性蛋白，制备了专化性很强的抗血清。

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