不同窖龄窖泥细菌的系统发育多样性分析

王明跃，张文学*，王海英，刘超兰

(1.阜阳职业技术学院，安徽 阜阳 236031；2.四川大学轻纺与食品学院，四川 成都 610065)

五粮液、泸州老窖等浓香型白酒以“窖香浓郁，绵甜醇厚、香味协调，回味悠长”的产品风格特征为广大消费者所喜爱，其窖香物质的来源主要是窖泥微生物在发酵过程中产生的有机酸和酯类等代谢产物。泥窖池是浓香型白酒特有的发酵容器，也是优良酿酒微生物栖息繁衍地，经过高酸度、高酒精和长期密闭发酵等酿酒环境的筛选和驯化，窖泥中逐渐富集了大量具有产香功能的厌氧细菌[1]。生产实践表明，窖池窖龄与酿酒质量关系极为密切，随着窖池使用年份的延长，窖泥逐渐趋于老熟，产生的香味物质越多，且有一种香沁脾胃的窖泥香味。长期以来，人们不断借助传统分离培养的方法对窖泥微生物区系的形成和演变规律进行研究，试图揭开“老窖出好酒”的谜团，由于窖泥大部分细菌是不可培养的，其研究结果具有很大的局限性，且收效甚微。

近几年，随着基于PCR扩增技术的各种微生物免培养方法应用于酿造微生物区系研究，使依赖于经典微生物研究方法而难于分析的大量微生物菌群的相关信息不断增加，王海英等[2]运用PCR-DGGE分析了白酒窖泥微生物群落结构，张文学等[3]利用16S rDNA克隆文库技术研究白酒发酵糟醅中微生物区系的构成及演变规律。因DGGE条带分布只能反映出微生物种群中的优势种，测定序列长度较短，提供微生物种群多样性信息非常有限[4]，尚不能系统地揭示窖泥的老熟机理，而16S rDNA克隆文库技术获得的种群分类信息相对客观真实[5]，因而被广泛用于揭示环境中微生物的多样性[6]，目前，利用克隆文库技术对窖泥微生物系统发育研究还鲜有文献报道。鉴于此，本实验通过构建低龄窖(20a)、中龄窖(50a)和高龄窖(150a)窖泥细菌的16S rDNA克隆文库，分析了浓香型白酒窖泥细菌随随窖龄的变化规律，以期全面、系统地认识白酒窖池细菌群落组成及与窖泥质量性状的关系。

1 材料与方法

1.1 样品采集

窖泥样品分别取自四川西部某国家名酒企业酿酒车间低龄窖(20a)、中龄窖(50a)和高龄窖(150a)窖池。取样方法是从每个窖池窖底4个角落和接近中心的一点各取50g窖泥，混合均匀，分装后密封冷冻保存。

1.2 方法

1.2.1 窖泥样品预处理及总DNA提取

为了充分提取窖泥样品中的总DNA，参照本实验室窖泥样品预处理方法[7]，向0.5g窖泥中加入600μL裂解液，反复冻融，收集上清液，经基因组抽提试剂盒AC柱纯化，用于PCR扩增。

1.2.2 窖泥样品16S rDNA扩增

用细菌16S rDNA通用引物Eubac27f和Eubac1492r对所提取的窖泥样品DNA进行PCR扩增，PCR反应体系及反应程序参考文献[7]，扩增目的片段大小约为1500bp，PCR产物经切胶纯化后，冷冻保存备用。

1.2.3 窖泥样品克隆文库的构建

将上述PCR产物与pUCm-T载体进行连接反应，转化至大肠杆菌DH5α，涂布在含氨苄青霉素和X-gal、IPTG的LB平板，37℃培养12～16h，用无菌枪头挑取白斑菌落，转移至LB液体培养基的试管中，37℃、150r/min振荡培养过夜，取800μL培养好的菌液至EP管，离心洗涤后进行菌体PCR，其余菌液留作测序。

1.2.4 16S rDNA扩增片段的ARDRA分型和测序

将鉴定为阳性克隆子的PCR产物进行限制性酶切分析(ARDRA)，用MspⅠ和HinfⅠ两种限制性内切酶消化，综合双酶切图谱，将所有阳性克隆子分为若干分类操作单位(OTU)，其中，克隆子数量比例＞10%的OTUs为优势菌群，5%～10%之间的OTUs为次要优势菌群。将每个OTU类型挑取1～3个进行双向测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。所得合格序列均已提交日本国际基因数据库DDBJ，序列登录号：AB699152，AB699883～AB699898，AB700373～AB700425。

1.2.5 16S rDNA序列分析及系统发育树构建

将所得序列通过Geengenes在线分析检查，去除嵌合体(chimera)，然后在NCBI数据库进行BLAST同源性比对，结合Ribosomal Database Project11分类结果，挑选最相似的亲缘序列。利用Clustal X 1.83和Mega4.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)对选取的序列构建系统发育树。

1.2.6 数据统计分析

采用覆盖率[8]评价不同窖龄窖泥的库容情况：覆盖率/%=(1－n1/N)×100，式中：N代表窖泥文库中克隆子总数，n1为文库中只出现1次克隆子的数量。用EcoSim700软件绘制Rarefaction曲线，评价窖泥细菌文库是否较好地反映窖泥微细菌多样性。通过Biodap软件计算Shannon-Wiener多样性指数(H)和索伦森相似性系数(Sorensen similarity index)，评价不同窖龄窖泥的细菌多样性和相似程度。

2 结果与分析

2.1 窖泥样品16S rDNA克隆文库分析

从3个不同窖龄的窖泥中共挑选398个阳性克隆子，经ARDRA分析，共有66个OTUs。20、50、150a窖泥文库的覆盖率分别为97.1%、94.6%和97.8%，Rarefaction曲线趋于平缓，均达到平台期(图1)，说明所分析的克隆数已反映了窖泥中绝大部分的细菌多样性。

图 1 窖泥细菌16S rDNA克隆文库稀有度曲线Fig.1 Rarefaction curves generated for 16S rDNA in clone libraries from pit mud

所得序列经过Chimera检查去除嵌合体后，然后在NCBI数据库进行BLAST同源性比对，相似性为89%～100%，相似性≥97%的序列只选取一个代表序列[9]，最终得到37个不同基因型的OTUs，其中25个OTUs序列的相似性≤97%，说明大多数克隆(67.5%)属于“种”分类上的新发现的细菌。

表 1 不同窖龄窖泥细菌16S rDNA克隆文库的多样性和相似性Table 1 Diversity and similarity index of baeterial 16S rDNA clone libraries from the pit muds with different cellar ages

通过20、50、150a窖泥克隆文库的分析结果(表1)可知，随着窖龄的增加，窖泥细菌多样性指数逐渐增加，这说明窖泥中的细菌通过长期驯化，已经适应酸、酒精等酿酒特定环境，加之生产过程中周期性地续渣配料及酿酒过程中逐渐积累的有机酸、醇类等物质，久而久之，窖泥中优良菌种就逐渐丰富起来。窖泥细菌多样性指数从20～50a之间变化幅度较大，50～150a之间增加很小，两者菌群相似程度也达到70.8%，说明窖泥中的菌群经过50a的连续发酵，已趋于稳定平衡状态。

2.2 窖泥细菌16S rDNA系统发育及代谢特性分析

由图2 系统发育分析结果表明，3 7 个基因型分属于6个细菌门：厚壁菌门(Firmicute)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和未分类细菌(Unclassified Bacteria)。

厚壁菌门(Firmicute)包括25个OTUs，占克隆子数的65.1%，是窖泥中的绝对优势菌，同源性比对相似性为90%～99%，在系统发育树中聚成7个簇。

Cluster Ⅰ和Cluster Ⅶ属于未分类的梭菌目(Clostridiales)和未分类的梭菌纲(Clostridia)，它们主要来自中龄(50a)、高龄(150a)窖泥，缺乏种属分类信息，预示着中、高龄窖泥中蕴藏着丰富的未知微生物资源。其中AB700386为中、高龄窖泥优势菌，与来自渗滤液沉积物的克隆Uncultured bacterium clone De3230相似性为96%，可能是与甲烷菌共生，并能产生氢气的细菌类群[10]，其数量和代谢能力是窖泥老熟的重要标志之一。

ClusterⅡ只有AB699887一个克隆，相似于Uncultured Caloramator sp.6b(95%)，在RDP数据库中的分类却属于Fervidicella，可能是Fervidicella中未发现的新种。

Cluster Ⅲ类群克隆分属于4 个属，AB700409属于Anaerovorax，AB699895属于Proteiniborus。AB699897为20a窖龄窖泥次优势菌，相似于Uncultured Eubacteriaceae 08-2-D03(99%)，属于Eubacterium，AB700382是50a窖龄窖泥次优势菌，相似于Uncultured Sedimentibacter sp. XZXXH123(94%)，这两个种属的细菌能够产生乙酸和丙酸[11-12]。

ClusterⅣ是Ruminococcaceae类群，AB69988在3个不同窖龄窖泥中均有克隆检出，相似于铁还原细菌Ironreducing bacterium(95%)，能将窖泥中的铁化合物从氧化态转化成还原态，使窖泥颜色则有由红棕黄褐等转向灰白青，表现为老熟特征。AB699883相似于Uncultured Clostridium sp.B03(93%)，AB700411相似于Uncultured Clostridium sp.J4(96%)，Clostridium能够利用乙醇和乙酸而成己酸，进而生成浓香型白酒主要香味成分己酸乙酯[13]，是浓香型白酒生产中重要的功能菌，如泸型梭菌(Clostridium Lushun)等菌株已广泛应用于人工窖泥的生产[14]。

图 2 窖泥厚壁菌门细菌16S rDNA克隆系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the16S rDNA sequences of Firmicute clones obtained from pit mud

ClusterⅤ是Syntrophomonadaceae类群，AB699889和AB699894均相似于互营共养单胞Syntrophomonas curvata GB8-1(96%，98%)，常常和产甲烷菌共生，能够降解长链脂肪酸产生氢气、乙酸、丙酸[15]。Syntrophomonas在3个不同窖龄窖泥中均有分布，在低龄(20a)窖泥中包括AB699889和AB699894两个种属，其中AB699889是20a窖泥第一优势OTUs，所占比例为20.7%，在中龄(50a)、高龄(150a)窖泥比例下降，分别只占6.9%和6.0%。AB700414属于Pelospora能发酵葡萄糖产生丁酸和异丁酸[16]。AB699896和AB699898只在20a的低龄窖泥中检出，均相似于Syntrophaceticus schinkii Sp3(95%，96%)，能够氧化降解乙酸[17]。

ClusterⅥ是Thermoanaerobacteraceae类群，AB700401和AB700407均相似于Uncultured Natronoanaerobium sp.De2145 (99%，96%)，是中、高龄窖主要优势菌，能够利用CO2和H2作为能源和碳源，将SO42-还原成S2-，Fe3+还原成Fe2+[18]，进而与生成难溶性的FeS，减少乳酸亚铁的积累和结晶，延缓窖泥老化，同时也使窖泥呈现乌黑色，呈现出老窖的特征。因此，AB700401和AB700407在窖泥老熟过程中起着重要的作用。

拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿屈挠菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Acrinobacreria)、变形菌门(Proteobacteria)和未分类细菌(Unclassified Bacteria)5个类群的系统发育树如图3所示。

图 3 窖泥拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门、变形菌门和未分类细菌16S rDNA克隆系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of Bacteroidetes, Chloroflexi, Acrinobacreria, Proteobacteria and unclassified bacteria clones from pit mud

拟杆菌门(Bacteroidetes)仅次于厚壁菌门的第二大类群，占克隆子数的21.4%。保括Alkaliflexus、Petrimonas、Proteiniphilum和Unclassified Bacteria。AB699891在3个窖龄窖泥中均有分布，是20a窖龄窖泥优势菌，相似于紫单胞菌属Petrimonas sulfuriphila BN3(99%)，能够发酵葡萄糖产生乙酸、CO2和H2，将S还原成H2S[19]，低龄窖白酒中H2S含量一般较高，与此菌代谢有一定关系。AB699892是20a窖泥优势菌，相似于Uncultured Porphyromonadaceae bacterium clone H-170(97%)，属于Proteiniphilum，能够产生乙酸和丙酸[20]。

绿弯菌门(Chloroflexi)含有2个OTUs，占克隆数量的4.8%。AB700397为50a窖龄窖泥优势菌，相似于Uncultured Longilinea sp.145(99%)，能分解果胶、果糖等碳水化合物，为产甲烷菌提供H2原料[21]。

放线菌门(Actinobacteria)仅含有1个OTU，占克隆数量的3.8%。AB700403相似于Uncultured Actinobacterium De210(99%)，仅在中、高龄窖泥中检出，张肖克等[22]研究发现，随窖泥不断老熟，放线菌不断递增。该相似菌株的功能未见报道，而且传统观点认为放线菌在酿酒中的作用不大，不过曹兰兰等[23]从盐湖中分离了14株产酯酶的放线菌，而酯酶对于浓香型白酒中的主体香味物质酯类的产生起着重要的作用，因此，应加强窖泥放线菌的分离和功能研究。

变形菌门(Proteobacteria)和未分类细菌(Unclassified Bacteria)所占比例很小，分别为1.0%和3.9%。

3 讨 论

经过对16S rDNA克隆文库的统计分析，厚壁菌门(Firmicute)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为窖泥两大优势菌群，分别占65.1%、21.4%。在对不同窖龄窖泥主要优势菌的分析中，发现不同窖龄的优势菌群有很大差异，低龄(20a)窖泥优势菌为Syntrophomonas、Petrimonas和Proteiniphilum，从代谢特征分析，三者均是产乙酸细菌，它们在中龄(50a)、高龄(150a)窖泥中显著减少，窖泥浸出液检测结果也表明乙酸和乙酸乙酯在低龄窖泥中的含量明显高于中、高龄窖泥[24]，乙酸含量过高，会掩盖酒体主体香，导致浓香味不突出。而中龄(50a)、高龄(150a)窖泥优势菌为Natronoanaerobium和Unclassified Clostrida，两者在系统发育树上相聚较近，其代谢产物对白酒的风味的贡献似乎不大，推测它们是老熟窖泥稳定环境的维护者，是窖泥老熟的重要标志之一。传统分离培养鉴定结果表明，窖泥中优势细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)和芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)[25]，与本次克隆结果并不一致，这可能是由于窖泥未培养微生物较多(73.9%)，而人工培养改变了窖泥微生物的原始生长环境，从而导致了某些可培养细菌在培养基中的反复频繁出现，这与马鸣超等[26]结论一样，即人工分离培养得到的优势菌并不一定是真正生态学意义上的优势菌。另一方面，在构建16S rDNA克隆文库时，引物的“通用性”是相对的，因此，要结合多种方法，才能全面客观地了解不同窖龄细菌的生态分布。本课题组拟利用获得的细菌克隆序列信息，设计一系列引物探针，利用实时荧光定量PCR仪进一步检测不同窖龄窖泥的优势菌和特征菌含量，并结合PCR-DGGE图谱，构建窖泥细菌分子指纹图谱和相关数学模型。

不同窖龄窖泥细菌的Shannon-Wiener多样性指数在2.39～2.86之间，20a窖泥细菌多样性指数最低，可能是引起低龄窖酒质口感单薄的重要原因之一，而中、高龄窖泥微生物的多样性较高，微生物产生的香味物质也越多，其香气就更浓郁、酒体也会醇厚饱满。不同窖龄窖泥细菌群落相似性系数0.465～0.708之间，50a和150a窖龄的群落结构较为相似，这说明窖泥中的细菌过50a漫长的驯化和演替，其微生物群落结构趋于稳定，所产生的香味成分也趋于稳定和协调，人们常说“千年老窖万年糟，酒好全凭窖池老”，也就是这个原因。

由此可见，通过16S rDNA克隆文库技术系统地认识了不同窖龄窖泥细菌群落的基本构成及演替规律，揭示了不同窖龄窖泥细菌系统发育多样性与窖泥性状、所产酒质的关系，为窖泥质量标准的建立奠定了基础。

[1] 余有贵, 李侦, 熊翔, 等. 窖泥微生态的主要特征研究[J]. 食品科学, 2009, 30(21)： 258-261.

[2] 王海英, 张文学, 施思. 水井坊窖底泥微生物群落结构的DGGE分析[J]. 中国酿造, 2012, 31(2)： 38-40.

[3] 张文学, 乔宗伟, 胡承, 等. PCR技术对浓香型白酒糟醅细菌菌群的解析[J]. 四川大学学报： 工程科学版, 2005, 37(5)： 82-87.

[4] CEBRON A, COCI M, GARNIER J, et al. Denaturing gradient gel electrophoretic analysis of ammoniaoxidizing bacterial community structure in the lower Seine River： impact of Paris wastewater effluents[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(11)： 6726-6737.

[5] 柏耀辉, 孙庆华, 温东辉. 分子生态技术在微生物硝化及反硝化研究中的应用[J]. 北京大学学报： 自然科学版, 2011, 47(2)： 378-384.

[6] ULRICH A, BECKER R. Soil parent material is a key determinant of the bacterial community structure in arable soils[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 56(3)： 430-443.

[7] 施思, 张文学, 邓宇, 等. 用DGGE 技术构建白酒酿造微生物指纹图谱的初步研究[J]. 中国酿造, 2010(1)： 118-120.

[8] GOOD I J. The population frequencies of species and the estimation of population parameters[J]. Biometrika, 1953, 40： 237-264.

[9] DRANCOURT M, BOLLET C, CARLIOZ A, et al. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38： 3623-3630.

[10] LIU Jingjing, WU Weixiang, CHEN Chongjun, et al. Prokaryotic diversity, composition structure, and phylogenetic analysis of microbial communities in leachate sediment ecosystems[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91(6)： 1659-1675.

[11] CHEESEMAN S L, HIOM S J, WEIGHTMAN A J, et al. Phylogeny of oral asaccharolytic Eubacterium species determined by 16S ribosomal DNA sequence comparison and proposal of Eubacterium infimum sp. nov. and Eubacterium tardum sp. nov.[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 1996, 46(4)： 957-959.

[12] TAKII S, HANADA S, TAMAKI H, et al. Dethiosulfatibacter aminovorans gen. nov., sp. nov., a novel thiosulfate-reducing bacterium isolated from coastal marine sediment via sulfate-reducing enrichment with Casamino acids[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2007, 57(10)： 2320-2326.

[13] KENCALY W R, CAO Y, WEIMCR P J. Production of caproic acid by cocultures of ruminal cellulolytic bacteria and Clostridium kluyveri grown on cellulose and ethanol[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 44： 507-513.

[14] 吴衍庸. 泸型梭菌己酸发酵应用的理论与实践[J]. 酿酒科技, 2007(11)： 131-133.

[15] ZHANG Chunyang, LIU Xiaoli, DONG Xiuzhu. Syntrophomonas curvata sp. nov., an anaerobe that degrades fatty acids in co-culture with methanogens[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2004, 54(3)： 969-973.

[16] MATTHIES C, SPRINGER N, LUDWIG W, et al. Pelospora glutarica gen. nov., sp. nov., a glutarate-fermenting, strictly anaerobic, spore-forming bacterium[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2000, 50(2)： 645-648.

[17] WESTERHOLM M, ROOS S, SCHNÜRER A. Syntrophaceticus schinkii gen. nov., sp. nov., an anaerobic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium isolated from a mesophilic anaerobic filter[J]. FEMS Microbiol Letters, 2010, 309(1)： 100-104.

[18] KAKSONEN A H, PLUMB J J, ROBERTSON W J, et al. Novel thermophilic sulfate-reducing bacteria from a geothermally active underground mine in Japan[J]. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(5)： 3759-3762.

[19] GRABOWSKI A, TINDALL B J, BARDIN V, et al. Petrimonas sulfuriphila gen. nov., sp. nov., a mesophilic fermentative bacterium isolated from a biodegraded oil reservoir[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2005, 55(3)： 1113-1121.

[20] CHEN Shuangya, DONG Xiuzhu. Proteiniphilum acetatigenes gen. nov., sp. nov., from a UASB reactor treating brewery wastewater[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2005, 55(6)： 2257-2261.

[21] YAMADA T, IMACHI H, OHASHI A, et al. Bellilinea caldifistulae gen. nov., sp. nov. and Longilinea arvoryzae gen. nov., sp. nov., strictly anaerobic, filamentous bacteria of the phylum Chloroflexi isolated from methanogenic propionate-degrading consortia[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2007, 57(10)： 2299-2306.

[22] 张肖克, 黄永光, 胡晓瑜. 窖泥糟醅发酵过程微生物多态性特征[J]. 酿酒科技, 2006(1)： 65-72.

[23] 曹兰兰, 王芸, 唐蜀昆. 新疆哈密地区盐湖放线菌的多样性及其功能酶的筛选[J]. 微生物学报, 2009, 49(3)： 287-293.

[24] 卫春会, 甄攀, 罗惠波. 等. 采用气相色谱质谱联用技术对不同窖龄窖泥浸出液的分析研究[J]. 食品工业科技, 2011, 32(2)： 95-97.

[25] 岳元媛, 张文学, 刘霞. 浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分离鉴定[J]. 微生物学通报, 2007, 34(2)： 251-255.

[26] 马鸣超, 姜昕, 李俊. 应用16SrDNA克隆文库解析人工快速渗滤系统细菌种群多样性[J]. 微生物学通报, 2008, 35(5)： 731-736.