实验制粉去除小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的研究

陈 飞，刘 阳*，邢福国

(中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalnol，DON)是一种单端孢霉烯族毒素，主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米、黑麦等谷物[1-2]，常由镰刀菌亚洲型(Fusarium asiaticum)、禾谷镰刀菌(F. graminearum)和黄色镰刀菌(F. culmorum)产生[3-4]。单端孢霉烯族毒素是粮食中最常见的一类污染性霉菌毒素[5-11]，联合国粮农组织和世界卫生组织1973年联合召开的第3次食品添加剂和污染物会议上，把单端孢霉烯族毒素定为最危险的自然发生食品污染物之一，列入国际研究的优先地位，而其中DON毒素污染粮食最为普遍。DON毒素具有很强的细胞毒性和遗传毒性，严重危害人畜的健康，越来越受到国内外的重视[12-13]。

DON污染小麦的情况在世界范围内普遍发生[8-10,14]，特别在我国南方地区、美国北部、阿根廷等地，小麦在扬花期至成熟期间的温暖多雨、入夏后的持续高温多雨及洪涝灾害等气候更易于小麦感染霉菌，而产生大量DON毒素。

中国作为一个主要以植源性食物为主的国家，特别在北方多以面制品作为主食，污染DON毒素小麦的潜在危害会更大。因此，如何去除小麦中的DON毒素，减少其进入面制品乃至食物链的含量显得越来越迫切。目前DON的脱毒方法主要包括物理方法(吸附、研磨、漂洗等)、化学方法(加氨、次氯酸，热处理等)和生物方法(微生物吸附、酶降解等)[15]。而食品加工中一般涉及到上面所述的物理、化学和生物的去除毒素过程，去除镰刀菌毒素效果比较明显[16]。国内关于此相关方面的研究较少，其中陆刚等[17]研究了剥皮制粉工艺去除小麦中DON毒素的效果，梁斌[18]研究了工业制粉工艺对DON毒素的去除作用，但两者都是从工业水平上、通过检测单一DON毒素含量的小麦在工艺前后各产品的DON含量来研究制粉工艺对DON的去除效果，缺乏系统研究，且未涉及到实验制粉工艺。本研究通过检测DON污染程度不同的小麦经过实验制粉工艺得到多道面粉、麸皮和细麸中的DON含量，探索小麦制粉工艺去除DON的效果，降低小麦及其制品中DON毒素的含量，减少其进入食物链的程度，保障人体健康。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦样品A～I均采自于我国江淮流域小麦主产区的2个省份(2010年10月)，均为冬小麦。其中，小麦A、B、C品种为郑麦9023，小麦D、E品种为宁麦15，小麦F、H品种为烟农19，小麦G、I品种为扬麦13。小麦中的DON毒素均为自然条件下感染。

DON标准品 美国Sigma公司；乙腈(分析纯) 北京化学试剂公司；乙腈、甲醇(色谱纯) 美国Fisher公司；蒸馏水 中国农业大学；纯净水 娃哈哈集团；氮气(纯度99.999%) 北京北温气体制造厂。

1.2 仪器与设备

MLU-202型布勒实验磨粉机 瑞士布勒公司；微型高速万能试样粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；Sigma 1-14小型高速离心机 美国Sigma公司；Bond ElutRMycotoxin净化柱 美国Agilent公司；氮气吹扫仪 杭州奥威仪器有限公司；Waters 2695高效液相色谱系统(配有Waters 2478紫外检测器) 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 小麦实验制粉

采用布勒实验磨粉机，参照小麦实验制粉标准：第1部分，设备、样品制备和润麦(NY/T 1094.1—2006《小麦实验制粉》)；第2部分，布勒氏法 用于硬麦(NY/T 1094.2—2006《小麦实验制粉》)和第4部分，布勒氏法用于软麦统粉(NY/T 1094.4—2006《小麦实验制粉》)。

取小麦样品清理后得到1000g净麦，按照GB 5947—1985《生活饮用水卫生标准》推荐的105℃恒质量法测定净麦水分含量，计算润麦所需的水分，通过两步润麦法，使硬质小麦的水分达到16%，润麦24h，软质小麦的水分达到14.5%，润麦22h。磨粉间的温度控制在20～24℃、湿度为60%～70%，以保证实验结果的再现性。每个样品磨粉之前将磨空转30min，进行清理，以避免样品间的交叉感染。清理完毕后，将样品倒入磨料斗中，开动实验磨即可。最后得到皮磨粉1B、2B、3B，心磨粉1M、2M、3M，细麸和麸皮8种组分，并分别进行收集、称质量。其中，小麦A～D检测上述6种粉路的面粉DON含量后，再将各粉路面粉混匀成统粉，而小麦E～I磨完后直接将6种粉路面粉混匀，得到统粉。

1.3.2 出粉率计算公式

统粉出粉率/%=(m1B＋m2B＋m3B＋m1M＋m2M＋m3M)/m×100

式中：m1B、m2B、m3B、m1M、m2M、m3M分别为1皮粉、2皮粉、3皮粉、1心粉、2心粉、3心粉的面粉质量/g；m为入磨前净麦质量/g。

1.3.3 DON提取、净化与检测

1.3.3.1 DON提取

为获得具有代表性的样本，所有组分都必须均匀等分，而且最终磨碎，使样品粒度小于500μm。准确称取5g，样品置于100mL三角瓶中，加35mL乙腈-水溶液(84：16，V/V)，用分散器振荡3min，混合均匀后，倒入容量瓶中，添加乙腈-水溶液(84：16，V/V)定容至50mL，将定性滤纸折叠过滤样品液，获得上清液。

1.3.3.2 DON净化

分别准确吸取上清液约3 m L，过B o n d E l u tRMycotoxin净化柱；精确吸取净化液2mL，转移至刻度试管中，用氮气吹扫仪50℃条件下，氮吹至干。加入1.5mL流动相，振荡1min混匀后，转入2mL离心管，10000r/min高速离心6min，上清液转入2mL微量进样瓶内。

1.3.3.3 DON检测

测定方法参照Liu[19]、Sugita-Konsihi[20]等报道的方法，采用Waters 2695高效液相色谱系统检测，C18色谱柱(3.9mm×150mm，5μm)净化，流动相使用乙腈-甲醇-水(5：5：90，V/V)，流速为1.0mL/min。检测条件为：柱温40℃，进样量10μL，紫外检测波长220nm。

2 结果与分析

2.1 DON污染对小麦出粉率的影响

小麦A、B、C、D依1.2节所述方法通过布勒氏制粉，得到8种组分，各组分的质量、DON含量与总量如表1所示，同一品种小麦A、B、C的出粉率如表2所示。

表 1 小麦制粉前后各组分质量及DON含量变化与总量分布表(±s，n=3)Table 1 DON distribution in different parts of wheat after milling treatment (±s，n=3)

表 1 小麦制粉前后各组分质量及DON含量变化与总量分布表(±s，n=3)Table 1 DON distribution in different parts of wheat after milling treatment (±s，n=3)

注：DON 含量均基于干物质含量计算。下同。

样品组分质量/g DON含量/(mg/kg) DON含量变化/% DON总量/mg 组分所占比率/%小麦A籽粒10000.78 ± 0.090.78 麸皮200.612.27 ± 0.05191.030.46 58.38细麸75.511.47 ± 0.1488.460.11 14.23 1B粉72.820.36 ± 0.04－53.850.03 3.36 2B粉76.450.42 ± 0.05－46.150.03 4.12 3B粉25.980.51 ± 0.06－34.620.01 1.70 1M粉483.140.23 ± 0.02－70.510.11 14.25 2M粉87.300.57 ± 0.07－26.920.05 6.38 3M粉19.480.49 ± 0.04－37.180.01 1.22统粉764.900.32 ± 0.03－58.970.24 31.38小麦B籽粒10001.18 ± 0.101.18 麸皮207.522.55 ± 0.08116.100.53 44.85细麸63.322.08 ± 0.2476.270.13 11.16 1B粉66.960.67 ± 0.05－43.220.04 3.80 2B粉72.970.75 ± 0.06－36.440.05 4.64 3B粉21.440.78 ± 0.07－33.900.02 1.42 1M粉494.100.75 ± 0.05－36.440.37 31.40 2M粉81.810.65 ± 0.07－44.920.05 4.51 3M粉13.470.89 ± 0.13－24.580.01 1.02统粉750.500.73 ± 0.17－38.140.55 46.43小麦C籽粒10001.50 ± 0.161.50 麸皮239.923.19 ± 0.40112.670.77 51.02细麸60.632.07 ± 0.3338.000.13 8.37 1B粉65.250.85 ± 0.09－43.330.06 3.70 2B粉78.261.02 ± 0.06－32.000.08 5.32 3B粉35.581.20 ± 0.17－20.000.04 2.85 1M粉458.230.70 ± 0.04－53.330.32 21.38 2M粉91.240.88 ± 0.06－41.330.08 5.35 3M粉19.711.34 ± 0.13－10.670.03 1.76统粉7480.78 ± 0.08－48.000.58 38.90小麦D籽粒10002.98 ± 0.312.98 麸皮2265.11 ± 0.2571.481.15 38.75细麸52.996.01 ± 0.64101.680.32 10.69 1B粉76.512.18 ± 0.33－26.850.17 5.60 2B粉81.002.34 ± 0.19－21.480.19 6.36 3B粉3.332.23 ± 0.30－25.170.01 0.25 1M粉483.261.74 ± 0.22－41.610.84 28.22 2M粉74.942.78 ± 0.18－6.710.21 6.99 3M粉30.832.88 ± 0.08－3.360.09 2.98统粉766.502.00 ± 0.11－32.891.53 51.44

表 2 同一小麦品种A、B、C通过制粉后的出粉率Table 2 DON content and flour yield from wheat cultivars A, B and C

由表2可得，同一品种的小麦A、B、C经过制粉后出粉率依次为69.07%、67.79%和67.56%，DON含量高的小麦的出粉率最小，含量低的小麦的出粉率最大。表明小麦出粉率随着小麦中DON含量升高而逐渐降低。并且，由表1可以得出，小麦A、B、C、D所得麸皮的DON含量分别为其小麦籽粒的2.91、2.16、2.13、1.71倍，小麦麸皮相对于小麦中的DON含量随着小麦DON含量的升高而逐渐降低，也验证了随着DON含量的增加，意味着真菌会不断侵蚀小麦内部，导致DON毒素也不断向胚乳部分转移。因此，采用重力作用对小麦进行分级，去除污染DON严重的轻质小麦，在提高小麦出粉率的同时，也有助于减少制得面粉中DON毒素含量。

小麦C中DON含量较高，污染较为严重，真菌已经缓慢迁入小麦籽粒内侧，致使污染胚乳的程度加大，并不断侵蚀小麦胚乳，致使小麦中胚乳含量不断减少，小麦籽粒不再饱满，会产生部分空扁、干瘪的情况，致使单个小麦籽粒质量下降，由胚乳部分所制得的面粉含量也不断降低，出粉率下降。

2.2 DON在小麦籽粒中的分布

小麦经过制粉前后各组分中DON含量变化如表1所示。在制粉过程中，外皮主要得到麸皮、细麸，内层胚乳则得到面粉，包含1B粉、2B粉、3B粉、1M粉、2M粉、3M粉。由表1可知，麸皮和细麸的DON含量要明显高于小麦籽粒和面粉的DON含量，并由之推断小麦中的DON含量主要集中在小麦的皮层部分。且由小麦皮层部分得到的细麸和麸皮的DON总量分别占到小麦DON总量的72.61%、56.01%、59.39%、49.44%，表明DON含量越高的小麦，其内部胚乳部分的DON总量所占的比重也越大。验证了DON主要分布在小麦皮层，并随着DON含量的增加，DON逐渐从外部皮层向内部胚乳部分侵染。因此，在小麦清理过程中，必须重视对高DON含量的小麦清理，以去除DON含量较高的小麦籽粒，确保面粉的质量安全。

图 1 小麦经过制粉得到不同粉路面粉的DON含量差异Fig.1 Comparison of DON content among different wheat cultivars and different flour mill streams

小麦经过制粉得到不同粉路面粉的DON含量变化如图1所示，小麦A、B、C、D的多点粉路中从1B粉到3B粉，1M粉到3M粉，其DON基本上都呈上升的趋势，而且在皮磨粉中1B粉的DON含量、心磨粉中1M粉的DON含量都是最小的。根据现代制粉工艺流程一般强调垂直流向、轻研细分的原理，各系统的面粉从小麦胚乳的不同部位而得，基本能体现胚乳内各部分的组成及性质[21]。而布勒氏实验磨则是按照现代制粉原理来模拟制成的，其得出的各个粉点也基本代表了小麦胚乳的各个不同部分，在整个粉路中，3B及3M粉最接近小麦皮层部分，1M和1B粉最接近胚乳中心部分[22-23]。表明，在小麦胚乳部分中，DON也是从内往外逐渐增高的，真菌是不断从外部向内部侵染的，小麦胚乳中心DON含量最低。

2.3 小麦中DON的去除效果

由表1可知，小麦经过实验制粉后，存留在面粉中的DON总量仅为原来小麦的31.03%～50.39%，其余部分都残留在小麦麸皮和细麸中。通过小麦实验制粉工艺，可以起到将小麦中的DON毒素进行有效去除的作用，得到DON毒素含量较低的面粉，而面粉是实际生产中面制品的主要原料。

为研究制粉工艺去除小麦DON的效果，还选用了小麦E～I进行布勒氏制粉，并检测其中籽粒和面粉的DON含量，所有小麦籽粒初始DON含量和最后得到面粉的DON含量如表3所示。小麦籽粒DON含量分别为0.78～9.78mg/kg，共分9个梯度，得到的面粉DON含量为0.32～7.33mg/kg。经过实验制粉后，面粉中DON含量相对于小麦最高减少了58.97%，最低减少了23.67%，并且基本上呈小麦中DON含量越高，制得面粉中DON含量减少越少的趋势。

表 3 不同DON含量小麦经过实验制粉前后DON含量的变化(±s，n=3)TTaabbllee 33 CCoommppaarriissoonn ooff DDOONN ccoonntteenntt bbeettwweeeenn fflolouurr aanndd wwhheeaatt ffrroomm different cultivars (±s，n=3)

表 3 不同DON含量小麦经过实验制粉前后DON含量的变化(±s，n=3)TTaabbllee 33 CCoommppaarriissoonn ooff DDOONN ccoonntteenntt bbeettwweeeenn fflolouurr aanndd wwhheeaatt ffrroomm different cultivars (±s，n=3)

小麦种类籽粒DON含量/(mg/kg)面粉DON含量/(mg/kg)含量减少/%小麦A0.78 ± 0.090.32 ± 0.0358.97小麦B1.18 ± 0.100.73 ± 0.1738.14小麦C1.50 ± 0.160.78 ± 0.0848.00小麦D2.98 ± 0.312.00 ± 0.1132.89小麦E2.22 ± 0.161.30 ± 0.0841.44小麦F4.21 ± 0.232.71 ± 0.0935.63小麦G5.49 ± 0.083.92 ± 0.2228.60小麦H6.59 ± 0.415.03 ± 0.1923.67小麦I9.78 ± 0.367.33 ± 0.3525.05

通过小麦制粉工艺，可得到DON含量明显减少的面粉，DON含量越高的小麦(小麦G)，经过制粉工艺得到面粉中DON减少的效果也越差，而DON含量较小的小麦(小麦A)，经过制粉工艺后，面粉中的DON含量相对小麦减少比例则较高。针对小麦籽粒DON含量与制得面粉中DON含量之间的关系，得出如图2所示的幂函数回归方程，回归方程为y =0.498x1.206(R2= 0.991)。从回归方程也可以得出，随着小麦中DON含量的增高，得到面粉中的DON含量随之呈幂函数增高，从而使制粉工艺去除小麦中DON含量的效果不断减弱。

图 2 小麦籽粒DON含量与制得面粉中DON含量的关系图Fig.2 Relationship of DON content between wheat grains and flour

3 讨论与结论

3.1 小麦清理过程去除DON的效果预测

以上可知，小麦中DON主要分布在其表层部位，而小麦清理中的小麦表皮处理过程主要作用就是通过打麦、碾麦等工艺来去除小麦表面杂质，因此，此过程也可去除小麦中部分的DON毒素。同时，在小麦采集过程中，发现污染DON较为严重的红色或灰色的患赤霉病小麦几乎均为瘪麦，质量较轻，可以通过小麦清理过程中的重力分级和风选过程来去除，而且若可以通过小麦色选技术筛选出大量被污染的红色和灰色的小麦，尤其是在白小麦的清理过程中，其去除小麦中DON的效果会更为显著。因此，预测小麦清理过程也将是去除DON的有效途径。

3.2 小麦品种与DON防控

在采集的小麦中，发现DON含量较高的小麦多为小麦赤霉病的中感、中抗的品种，如宁麦15、扬麦13；而DON含量较少的小麦则多为高抗小麦赤霉病的小麦品种如郑麦9023。因而，小麦抗性品种的推广对DON毒素的防控，特别是在小麦赤霉病多发地区，有着极为重要的作用。

通过研究小麦实验制粉工艺得到的面粉(包括皮磨粉1B、2B、3B，心磨粉1M、2M、3M)、麸皮、细麸的DON含量，得出经过小麦实验制粉工艺后，能够重新分配小麦中的DON毒素，存留在面粉中的DON总量仅为原来小麦的31.03%～50.39%，并且发现DON主要分布在小麦的表皮。经检测不同出粉点面粉的DON含量，得出在小麦胚乳中也呈从内到外逐渐升高，面粉中DON含量减少23.67%～58.97%，特别是1M粉中DON含量能够减少70.51%。小麦籽粒DON含量与制得面粉中DON含量之间呈幂函数回归关系，回归方程为y = 0.498x1.206(R2= 0.991)，随着DON污染程度越低，DON含量减少率越大。通过以上实验证明，小麦实验制粉工艺是种有效去除小麦中DON毒素的方法。

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