马面鱼骨胶原多肽的理化特性及其抗氧化活性

杨 露，丁利君*，蓝德安

(1.广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006；2.广州市华琪生物科技有限公司，广东 广州 510220)

马面鱼，学名叫绿鳍马面鲀(Navodon septentionalis)，属鲀形目单角鲀科马面鲀属鱼类[1]。1994年韩阳等[2]研究马面鱼油与鱼肉对老年高血压有明显的降血压作用，并无副作用。2000年陈丕茂等[3]分析了对绿鳍马面捕捞强度和开捕时间。2010年温海深等[4]研究了绿鳍马面鲀的繁殖与发育情况，为其繁殖与养殖提供了科学依据。

市场上由马面鱼加工而成的鱼糜、熟食、干制和罐头等多种食品，日渐被大众所接受和喜爱。鱼骨中蛋白质90%为胶原、骨胶原及软骨素(酸性黏多糖)，有增强皮下细胞代谢，延缓衰老的作用[5]。利用生物工程得到活性的骨胶原多肽能够促进人体新陈代谢，具有健脾胃、改善睡眠、延缓衰老、预防骨质疏松作用[5]。胶原多肽以相对分子质量小[6]、易吸收、抗氧化活性强[7]等特点受到高度重视，在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面有广阔前景[8]。将生产加工而产生的大量马面鱼骨制成生物活性多肽，能实现“鱼尽其用”，变废为宝，变低值为高值，达到提高经济价值、增加社会和经济效益的目的。

本实验主要探讨用生物酶工程技术与响应面法制备的马面鱼骨胶原多肽的基本理化特性及抗氧化功能性，为马面鱼骨的深入开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜马面鱼鱼骨，由北海味莱鲜海洋生物科技有限公司提供。

风味蛋白酶(酶活力3×104U/g) 广州市华琪生物科技有限公司；L-羟脯氨酸标准品 北京奇华盛生物技术发展中心；还原型谷胱甘肽标准品 北京普博欣生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯级。

自动凯式定氮分析仪 上海纤检仪器有限公司；LGJ-12冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Waters 510高效液相色谱 美国Waters公司；Ultraflex III型基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法(MALDI-TOF) 德国Bruker公司。

1.2 马面鱼骨胶原多肽的制备工艺

马面鱼骨洗净→粉碎→高压蒸煮→磨浆→生物酶解→初滤去渣→微滤→超滤→冷冻干燥→马面鱼骨多肽粉

1.3 马面鱼骨基本成分分析

水分测定：参照GB/T 13101—1991《西式蒸煮、烟熏火腿卫生标准》方法；灰分含量测定：参照GB/T 24872—2010《粮食检验 小麦粉灰分含量测定》方法；总氮含量测定：凯氏定氮法；粗脂肪含量测定：GB/T 5512—1985《粮食、油料检验 粗脂肪测定法》方法；水解度测定：游离氨基态氮甲醛快速滴定法[9]；氨基酸的测定：高效液相色谱分析法。

1.4 马面鱼骨多肽液的功能性检测分析

1.4.1 紫外吸收检测分析

吸取马面鱼骨粗胶原多肽液，加入蒸馏水，稀释10倍。以蒸馏水作参比，采用UV-2450紫外-可见分光光度计从波长190～400nm扫描，测定最大吸收峰[10]。

1.4.2 氨基酸组成分析

样品液中游离氨基酸组成采用高效液相色谱HPLC分析，总氨基酸组成参照刘艳[11]、Morre[12]等的方法将样品液酸解后采用HPLC分析。氨基酸色谱检测条件：PICO.TAG氨基酸分析柱，温度38℃，流速1mL/min，检测波长254nm。

1.4.3 质谱分析

采用MALDI-TOF质谱法。将样品配制到一定的质量浓度与基质α-4-氰羟肉桂酸(HCCA)混合均匀，点样，用质谱仪进行分子质量检测[13]。

1.5 抗氧化功能分析方法

1.5.1 还原力的测定方法

参考张强[14]、曹炜[15]等的方法测定胶原多肽的还原能力。

1.5.2 清除·OH的测定方法

参考张璟等[16]的方法测定对·OH的清除率。

1.5.3 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的测定方法

参考Xie Zhengjun等[17]的方法，分析鱼骨胶原多肽对DPPH自由基的清除效果。

2 结果与分析

2.1 马面鱼骨粉的基本成分分析

表 1 马面鱼骨粉的基本成分Table 1 Proximate analysis of N. septentionalis bone

新鲜马面鱼骨中水分达到70.83%，将其脱水干燥，制得马面鱼骨干粉。由表1可知，马面鱼骨干粉的蛋白质含量高达53.71%，灰分含量高达39.79%。马面鱼骨属于软骨类，其中含有丰富的软骨素及胶原蛋白质，适宜应用到化妆品类产品的开发与研制。

2.2 马面鱼骨胶原多肽粉的氨基酸分析

表 2 马面鱼骨粗胶原多肽的氨基酸成分Table 2 Amino acid composition of collagen from N. ptentionalis bone

采用高效液相色谱分析方法，分析马面鱼骨酶解、分离、干燥后制备的胶原多肽粉的氨基酸组成。由表2可知，马面鱼骨胶原多肽粉中总氨基酸含量达到77.42%，亚氨基酸中的羟脯氨酸和脯氨酸占总氨基酸成分的含量分别为2.66%和6.50%，马面鱼骨多肽粉的氨基酸组成与猪皮、牦牛骨[18]胶原多肽的氨基酸组成相似。马面鱼骨胶原多肽中还含有丰富的甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、赖氨酸，摄入此类多肽，能够保证氨基酸的营养均衡，粗胶原多肽具有较高的营养价值和保健功能。

2.3 马面鱼骨胶原多肽的紫外吸收光谱

图 1 马面鱼骨胶原多肽的紫外吸收光谱图Fig.1 UV absorption spectrum of collagen peptide from N. septentionalis bone

将马面鱼骨胶原多肽样品，经过UV-2450紫外-可见分光光度计扫描，确定其最大吸收峰。图1结果表明，其峰值在230nm左右，而在280nm处基本无吸收。这是因胶原蛋白只含有少量的芳香族氨基酸，而胶原蛋白被水解后得到的胶原肽链中含有的C—O、—COOH、CO—NH2都是生色基团，可以在220nm附近产生大的光吸收。所提取的胶原蛋白的最大吸收波长约220nm，这与曾少葵等[10]研究的罗非鱼鳞胶原蛋白的吸收特征相一致，符合胶原蛋白的特征吸收。

2.4 马面鱼骨胶原多肽的质谱分析结果

采用MALDI-TOF质谱法测定样品胶原蛋白多肽的分子质量分布范围，结果如图2所示，胶原多肽的分子质量分布在3kD以内，集中于1～2kD。因此说明胶原多肽的酶解效果较好，并且与蒋哲等[19]的鲨鱼皮胶原蛋白肽的分子质量分布比较接近，此方法对多肽分子质量的测定及分布具有指导意义。

图 2 胶原蛋白多肽的质谱分析图Fig.2 Mass spectrum of collagen peptide from N. septentionalis bone

2.5 马面鱼骨酶解液的抗氧化结果

2.5.1 马面鱼骨多肽液的还原力

图 3 鱼骨多肽与谷胱甘肽的还原力比较Fig.3 Reducing power of collagen peptide from N. septentionalis bone and GSH

由图3可知，随着胶原多肽质量浓度的增加，还原力不断上升。在60mg/mL时，鱼骨胶原多肽的还原力明显低于谷胱甘肽；但随着质量浓度继续增加，还原力远远超过谷胱甘肽。从整体趋势分析，吸光度越大，胶原多肽还原力越大；质量浓度越高，还原力越强，抗氧化能力越强[20]。此多肽具有良好的抗氧化功能，通过增加使用量能超过99%纯谷胱甘肽的抗氧化效果，具有明显的开发价值。

2.5.2 马面鱼骨胶原多肽酶解液对·OH的清除作用

图 4 鱼骨多肽与谷胱甘肽对·OH的清除作用比较Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of collagen peptid from N. septentionalis bone in comparsion with that of GSH

由图4可知，鱼骨多肽在高质量浓度条件下和谷胱甘肽相比，对·OH的清除作用强于谷胱甘肽。在低质量浓度范围内，清除作用随着质量浓度的增加而增加，在20mg/mL后，清除作用基本稳定。马面鱼骨在10mg/mL时呈微小的下降趋势，可能是马面鱼骨多肽液颜色的干扰及少量的混浊所致。当马面鱼骨胶原多肽的质量浓度为25mg/mL时，对·OH的清除率达到95.98%。但从整体趋势分析，马面鱼骨胶原多肽液清除·OH效果明显，可针对性地应用到具有·OH清除的食品及化妆品中。

2.5.3 马面鱼骨胶原多肽酶解液对DPPH自由基的清除作用

图 5 鱼骨多肽液与谷胱甘肽对DPPH自由基的清除作用比较Fig.5 DPPH radical scavenging activity of collagen peptid from N. septentionalis bone in comparsion with that of GSH

由图5可知，谷胱甘肽和马面鱼骨多肽液对DPPH自由基清除作用明显。谷胱甘肽纯度高，在2mg/mL时即具有96%的清除作用，而马面鱼骨多肽随着质量浓度的升高，清除作用呈现台阶式的上升。当达到10mg/mL时的清除作用达85%，接近谷胱甘肽。马面鱼骨胶原多肽的质量浓度为25mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到97.36%。从分析可知谷胱甘肽和鱼骨多肽的IC50分别为1.04mg/mL和5.88mg/mL。初步的研究为进一步的分离纯化，降低使用量、增加清除作用，提供了良好的科学依据。

3 结 论

通过以上的理化性质分析，马面鱼骨的胶原多肽的氨基酸成分分析中羟脯氨酸含量占总氨基酸含量约为2.66%，胶原多肽的组成主要是分子质量为1～3kD的混合物，并且具有很好的抗氧化活性。当其质量浓度为60mg/mL时，其抗氧化活性中的还原能力与谷胱甘肽相当，当马面鱼骨胶原多肽的质量浓度为25mg/mL时对·OH的清除率和DPPH自由基的清除率分别达到95.98%和97.36%。马面鱼骨胶原多肽，由于其具有良好的抗氧化活性，可以作为功能食品、医药产品、化妆品的添加物。

马面鱼骨系列的研究还需要继续更加深入地分析并分离出鱼骨胶原多肽液中的具有较强的抗氧化功能的多肽片段，提高单位质量浓度下的抗氧化作用，降低使用量，降低产品成本。目前在马面鱼骨的实际应用和生产方面，仍有大量鱼骨待合理的开发。

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