车前子总黄酮和总多糖粗提物的体外抗氧化性能及其对脑神经细胞的保护作用

胥 莉，李 阳，刘学波*

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

车前子(Semen Plantaginis Asiaticae)为多年生草本车前科植物车前(Plantago asiatica L.)或平车前(P. depressa Willd)的干燥成熟种子，具有药蔬兼用、药食同源之性，已被卫生部列为可用于保健食品的原料[1]。车前子的主要化学成分有多糖、黄酮、环烯醚萜类、车前子酸以及一些挥发油类[2]。医学研究证明车前子具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效[3-5]。

大量研究证明，体内活性氧积累所造成的氧化应激参与了许多慢性疾病的发生和发展过程[6]。活性氧攻击细胞造成蛋白质氧化、脂质过氧化和核酸断裂，进而影响细胞的正常功能，最终导致慢性疾病的发生[7]。研究证实，抗氧化物质可通过捕获和中和自由基、干预自由基作用的通路而抑制自由基对机体的伤害。天然抗氧化剂以其具有安全，高效和无毒副作用等优点而受到普遍关注。从植物中寻找天然抗氧化剂来干预氧化应激相关疾病的发生已成为当前功能食品研究中的热点。

已有研究发现，车前子提取物有较强的抗氧化功效[8-9]，是一种潜在的天然抗氧化剂，其中多糖类物质和黄酮类物质含量较高且具有明显的生物活性。然而关于车前子中黄酮和多糖抗氧化性的全面评价和比较却少有报道，二者在氧化应激相关疾病干预方面的研究也十分有限。本实验对车前子中总黄酮和总多糖的抗氧化活性进行探讨，并以6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y神经细胞死亡模型来初步研究车前子活性物质在干预神经退行性疾病方面的应用，以期为车前子功效的探究和相关产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

车前子，购自杨凌华仁堂大药房，粉碎后入袋4℃保存。人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y，购自中国科学院上海细胞库。

DMEM/F12培养基(含有10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素) 美国Hyclone公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 美国Sigma公司；2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ) 美国Sigma Aldrich Fluka公司；水溶性VE(Trolox) 美国Cayman化学试剂公司；三氯化铁、盐酸、浓硫酸、无水乙醇、无水甲醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700紫外分光光度计 日本岛津公司；微量移液器 德国Eppendorf公司；SC-3610低速台式离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；KQ3200E超声波清洗机 苏州昆山市超声仪器有限公司；RE-201D旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司；Model680酶标仪 美国伯乐公司；3110型细胞培养箱 美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 车前子总黄酮的提取

参照贲永光等[10]的方法并略作改动：准确称取10g车前子原料，加入250mL 40%乙醇，在50℃、超声功率400W的条件下提取30min，提取液在3500r/min条件下离心10min，收集上清液，重复提取一次，合并上清液。减压浓缩至约100mL，再用40%乙醇定容至150mL。

1.3.2 车前子总黄酮含量测定

以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法[11]测定总黄酮含量。芦丁标准曲线的制作：精密称取芦丁标准品0.03g，40%乙醇定容至50mL，即得0.60g/L的芦丁标准溶液。分别吸取芦丁标准溶液0～1.2mL，加入40%乙醇定容至5mL，加50g/L的亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀后放置10min，加100g/L硝酸铝溶液0.3mL，摇匀后放置10min，加40g/L氢氧化钠溶液4.0mL，再加40%乙醇定容至10mL，摇匀，放置15min。测定510nm波长处吸光度，以芦丁溶液的质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线为y = 11.112x + 0.0017(R² = 0.9992)。

实验组取总黄酮提取液0.5mL，加入40%乙醇定容至5mL，按照标准曲线制作的方法，得到实验组吸光度(A实验)。空白组分别取样品0.5mL，加入40%乙醇定容，测其510nm波长处吸光度(A空白)。则样品的吸光度(A样品)可用式(1)计算。

按标准曲线回归方程计算总黄酮提取液中总黄酮的含量，以芦丁计。

式中：ρ为提取液中总黄酮含量/(mg/mL)；ρ1为根据标准曲线计算出的总黄酮含量/(mg/mL)；V1为提取液定容体积/mL；V2为显色反应测定时取样体积/mL。

式中：Y为提取率/%；m为提取液中总黄酮质量/mg；m2为车前子原料质量/mg。

1.3.3 车前子多糖的提取

参照周超[12]的方法，水浸提法提取总多糖：准确称取10g车前子粉末，加入80%乙醇100mL，浸泡24h，间歇搅拌，3500r/min离心15min，沉淀于50℃烘箱干燥。干燥后的沉淀加入350mL蒸馏水，100℃水浴搅拌提取6h，3500r/min离心15min，上层清液旋转蒸发至滤液原体积的一半，加无水乙醇至体积为60%，4℃醇沉6h，抽滤后用蒸馏水定容至150mL。

1.3.4 车前子总多糖含量的测定

采用苯酚硫酸法[12]测定总多糖含量。标准曲线的制作：准确称取干燥至质量恒定的葡萄糖配制100μg/mL的葡萄糖标准液。分别取葡萄糖标准液0～1.2mL，加入蒸馏水使其共2.0mL，再加入6%的苯酚液1.0mL，浓硫酸5.0mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出迅速冷却至室温，490nm波长处测定吸光度。以葡萄糖溶液的质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线y = 0.0065x－0.0229(R² = 0.9932)。

实验组取0.0 1 m L 总多糖提取液，补加蒸馏水1.99mL，按照标准曲线制作的方法，得到吸光度(A实验)。空白组取0.01mL总多糖提取液，加入7.99mL蒸馏水摇匀，在490nm波长处测定吸光度(A空白)。则样品的吸光度(A样品)可用式(4)计算。

按标准曲线回归方程计算总多糖提取液中总多糖的含量，以葡萄糖计。

式中：ρ为提取液总多糖含量/(mg/mL)；ρ1为根据标准曲线计算出的总多糖含量/(mg/mL)；V1为提取液定容体积/mL；V2为显色反应测定时取样体积/mL。

式中：Y为多糖提取率/%；m为提取液中多糖质量/mg；m2为车前子原料质量/mg。

1.3.5 车前子提取物的抗氧化性

1.3.5.1 DPPH自由基的清除实验

准确称取10.01mg Trolox标准品，室温下放置30min，用蒸馏水超声波辅助溶解后，定容至200mL即为200μmol/L的Trolox溶液，稀释得到Trolox标准梯度液。分别取1mL标准梯度液，加入4.5mL的DPPH甲醇溶液(取7.88mg的DPPH用无水甲醇定容至200mL，得100μmol/L的DPPH甲醇溶液)，充分混匀，避光静置30min，波长517nm处测定其吸光度(A实验)。

分别作空白组、对照组。空白组以水代替样品(A空白)，对照组以甲醇代替DPPH甲醇溶液(A对照)。各组平行3次，按式(7)计算DPPH自由基清除率，并以Trolox浓度为横坐标/(μmol/L)，清除率为纵坐标做标准曲线。其回归方程为：y = 0.5083x－1.5032(R² = 0.9993)。

取总黄酮提取液和总多糖提取液，稀释成不同的质量浓度，按照标准曲线的制作方法测定DPPH自由基的清除率。

1.3.5.2 铁还原能力实验

将30mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3溶液按体积比10：1：1混合配制得到TPTZ工作液，分别吸取20～160μmol/L的Trolox标准溶液1mL与TPTZ工作液4.5mL，混匀后避光反应30min，于593nm波长处测定其吸光度(A实验)。

分别作空白组、对照组，空白组以水代替样品(A空白)，对照组以水代替TPTZ工作液(A对照)。

以Trolox浓度为横坐标，铁还原力为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y = 0.0075x－0.012(R² = 0.9998)。

将总黄酮提取液和总多糖提取液稀释至适宜的质量浓度，各取1mL样品稀释液按照标准曲线制作方法测定样品的铁还原力。

1.3.5.3 ABTS+·的清除实验

将7mmol/L的ABTS溶液10mL和7.35mmol/L的K2S2O8溶液5mL混合后在室温下避光放置16h形成ABTS储备液，使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734nm波长处的吸光度为0.70±0.02。分别吸取1mL Trolox标准梯度液与ABTS工作液5mL混合均匀，室温反应5min，于734nm波长处测定其吸光度(A实验)。

分别作空白组、对照组，空白组以水代替样品(A空白)，对照组以无水乙醇代替ABTS工作液(A对照)，按式(9)计算清除率。

以Trolox浓度为横坐标，ABTS+·清除率为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.5212x–0.1775(R2=0.9991)。

取1mL不同稀释倍数的总黄酮提取液和总多糖提取液，按照标准曲线制作方法，计算对应的清除率。

1.3.6 MTT实验

1.3.6.1 车前子提取液对SH-SY5Y细胞存活率的影响

消化收集细胞，细胞计数并调整细胞浓度至1×105个/mL，接种到96孔板中，每孔100μL，同时设置对照孔，置37℃、5% CO2培养箱中培养过夜。将2种车前子提取液用无血清DMEM/F12培养基10倍和100倍稀释，加入到96孔板中，每孔100μL，每组均设6复孔，继续培养24h，培养结束后，用无血清培养基清洗培养孔1次，每孔加入10μL 5mg/mL MTT溶液和100μL无血清培养基，作用4h后，小心吸去培养基。每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，置37℃摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪测量各孔在490nm的OD490nm值。按式(10)计算细胞存活率。

1.3.6.2 车前子提取物对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞死亡的影响

方法类似于1.3.6.1节，仅在2种提取液作用24h并清洗后，每孔加入100μL 6-OHDA溶液(终浓度200μmol/L)继续培养24h，之后进行MTT溶液检测。

1.4 数据分析

每个实验重复3次，用SPSS16.0进行数据计算与分析。

2 结果与分析

2.1 车前子总黄酮和粗多糖的提取

经计算，车前子总黄酮的提取率为1.54%，在实验所用的定容至150mL的总黄酮提取液中，总黄酮质量浓度为1.03mg/mL。车前子粗多糖的提取率为2.76%，在实验所用的定容至150mL的总多糖提取液中，粗多糖质量浓度为1.84mg/mL。

2.2 两种提取物的抗氧化活性

2.2.1 提取物清除DPPH自由基效果

图 1 车前子总黄酮对DPPH自由基的清除效果Fig.1 DPPH free radical scavenging ability of flavonoid from Semen Plantaginis

图 2 车前子总多糖对DPPH自由基的清除效果Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of polysaccharide from Semen Plantaginis

由图1、2可知，总多糖提取物在18.37～183.70mg/L范围内对该自由基的清除率为25.88%～92.93%，相当于53.87～185.7μmol/L的Trolox；总黄酮提取物在10.25～102.50mg/L范围内对该自由基的清除率为19.15%～94.10%，相当于40.63～188.10μmol/L的Trolox。DPPH自由基的清除率与车前子总黄酮、总多糖提取物的含量有显著的正相关性，总黄酮提取物和总多糖提取物的IC50值分别为49.20mg/L和77.42mg/L，此时Trolox的IC50值为25.03mg/L，表明车前子两种提取物在清除DPPH自由基方面能力较弱，同时，总黄酮提取物清除DPPH自由基的能力强于总多糖提取物。

2.2.2 提取物的铁还原能力

图 3 车前子总黄酮的还原力Fig.3 Ferric reducing power of flavonoid from Semen Plantaginis

由图3、4可知，两种提取物的含量与还原力呈现出显著的量效关系，总多糖提取物在18.37～61.17mg/L范围内，铁还原力为0.31～1.34，相当于55.90～180.70μmol/L的Trolox，而总黄酮提取物在10.25～33.83mg/L范围内，铁还原力为0.29～0.91，相当于39.61～122.60μmol/L的Trolox。此时Trolox的IC50值(此处IC50表示还原力为0.5时对应的样品质量浓度)为17.08mg/L，总黄酮提取物和总多糖提取物的IC50值分别为18.45mg/L和 20.71mg/L，表明车前子总黄酮和总多糖的还原力略小于Trolox，且车前子总黄酮的铁还原力强于总多糖。

图 4 车前子总多糖的还原力Fig.4 Ferric reducing power of polysaccharide from Semen Plantaginis

2.2.3 提取物清除ABTS+·的效果

图 5 车前子总黄酮对ABTS+·的清除率Fig.5 ABTS+· scavenging action of flavonoid from Semen Plantaginis

图 6 车前子总多糖对ABTS+·的清除率Fig.6 ABTS+· scavenging action of polysaccharide from Semen Plantaginis

由图5、6可知，车前子总多糖提取物在18.37～ 1 8 3.7 0 m g/L 范围内，对A B T S+·的清除率范围为30.74%～99.30%，相当于56.78～190.30μmol/L的Trolox；总黄酮提取物在10.25～102.50mg/L范围内，自由基清除率范围是25.69%～99.41%，相当于48.96～190.50μmol/L的Trolox。总黄酮和总多糖提取物清除ABTS+·的IC50值分别约为21.41mg/L和30.52mg/L，Trolox的IC50值为24.92mg/L。因此，在ABTS+·清除能力上，总黄酮提取物＞Trolox＞总多糖提取物。

2.3 MTT法检测结果

6-OHDA是脑内多巴胺的氧化代谢产物，它通过产生活性氧，造成线粒体的氧化损伤，继而引发细胞内一系列的级联反应，诱导脑神经细胞死亡[13]。6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞死亡模型是最常用的神经退行性疾病研究模型之一[14]。

2.3.1 车前子提取液对SH-SY5Y细胞存活率的影响

图 7 车前子提取物对SH-SY5Y细胞活力影响Fig.7 Effects of Semen Plantaginis extracts on SH-SY5Y cell viability

首先检测车前子总黄酮和总多糖提取物对SH-SY5Y细胞的毒性作用。由图7可知，车前子的两种提取液在实验所用质量浓度范围内对细胞都没有明显毒性，甚至在不同程度上促进了细胞的增殖。与对照组相比，总多糖提取物组显著促进了SH-SY5Y细胞的增殖。

2.3.2 车前子提取物对6-OHDA诱导SH-SY5Y损伤模型细胞存活率的影响

图 8 车前子提取物对6-OHDA诱导的SH-SY5Y损伤模型的影响Fig.8 Protective effects of Semen Plantaginis extract against 6-OHDAinduced SH-SY5Y cell death

由图8可知，车前子两种提取物对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞死亡均有抑制作用。神经细胞经200μmol/L 6-OHDA处理后，细胞存活率明显降低，仅为33.91%，而使用稀释10倍和100倍的车前子总多糖和总黄酮提取液预处理细胞，则可以有效的抑制6-OHDA诱导的细胞死亡，在10倍稀释提取液的作用下，细胞存活率提高至64.59%(总黄酮提取物处理组)和78.71%(总多糖提取物处理组)，二者与6-OHDA处理组相比具有极显著差异(P＜0.01)。结合以上实验数据，可以推断车前子提取物对细胞死亡的抑制作用可能与其清除自由基、发挥抗氧化作用，调节细胞的氧化应激状态有关。但其具体调节氧化应激的机制还需进一步研究。

3 结 论

超声波辅助提取车前子总黄酮，其提取率为1.54%，水浸提法提取车前子总多糖，其提取率为2.76%。

两种车前子提取物均具有一定的体外抗氧化性，二者在清除DPPH自由基的能力方面较弱，但清除ABTS+·活性和铁还原能力都接近于Trolox，具有较强的抗氧化活性，且整体上，车前子总黄酮的抗氧化能力强于总多糖。

车前子的两种提取物对SH-SY5Y神经细胞没有毒性，二者对神经毒性物质6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞死亡均有不同程度的抑制作用，且抑制效果呈现质量浓度依赖关系。

下一步的研究工作将对提取物中总黄酮和总多糖作进一步的分离、纯化和鉴定，探讨发挥抗氧化活性的主要单体成分，并通过动物实验和细胞实验揭示这些活性物质在神经退行性疾病方面发挥作用的相关机理。

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