金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性及其在牛奶中的抑菌应用

蔡天舒，王静雪*，林 洪，孔令红，李 萌

(中国海洋大学食品科学与工程学院，食品安全实验室，山东 青岛 266003)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常见的食源性致病菌之一，其与食品行业及医药领域的卫生和安全休戚相关[1-3]。由于该菌广泛存在于自然界中，所以，食品在加工、贮藏和配送的各个环节受其污染的几率较大。由金黄色葡萄球菌所引起的细菌性中毒和细菌性感染已经成为人们非常关注的突发性公共卫生事件。美国疾病控制中心显示，在美国由金黄色葡萄球菌所引起的食物中毒事件数量仅次于大肠埃希菌，居第2位，占细菌性食物中毒的33%，而在加拿大则占45%，在某些欧洲国家如匈牙利、芬兰等则占食物中毒事件的50%以上，近年来，我国每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位[4]。金黄色葡萄球菌主要的感染对象有奶、肉、蛋、水产品等[5-6]。同时，由于奶牛感染金黄色葡萄球菌可以造成乳房炎，使得牛奶中的金黄色葡萄球菌成为主要的病原菌。食用含有该菌的食品可能会引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和发烧等典型胃肠炎反应。

噬菌体(bacteriophage，简称phage)是能够感染细菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称。分为烈性噬菌体和温和性噬菌体，其中烈性噬菌体可以侵入特定细菌细胞内，通过酶作用破坏细胞壁，使细菌裂解[7]。因此，噬菌体可作为食品监测和生物防治食源性疾病中较好的选择。噬菌体作为一种生物抗菌剂具有针对性强、抗细菌耐药性和无残留等优点[8]。目前已有噬菌体用于食品生物防控的报道，如Listex_P100已经作为世界上第一个通过美国食品药品管理局(FDA)认证的噬菌体食品添加剂，用于抑制食品中的李斯特菌[9]。因此，本研究以引起食源性疾病的主要病原菌金黄色葡萄球菌为宿主菌，分离筛选出具有特异性的金黄色葡萄球菌噬菌体，对其进行理化和生物学特性的研究。并在此基础上，研究噬菌体对巴氏杀菌牛奶中金黄色葡萄球菌的抑菌作用，为进一步利用噬菌体控制、消除由食源性致病菌金黄色葡萄球菌引起的食品污染提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集2011年5月采集自青岛市团岛污水处理厂进水池污水，样品置于4℃冰箱中备用。

1.1.2 培养基和试剂

巴氏杀菌牛奶 市售。

营养琼脂、营养肉汤培养基、Baird-Parker培养基 北京陆桥技术有限公司。

SM缓冲液：MgSO4·7H2O 2g、NaCl 5.8g，50mL的1mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，加蒸馏水至1000mL。

1.1.3 菌株

金黄色葡萄球菌(ATCC6538) 北京陆桥技术有限公司。

1.2 噬菌体的分离及纯化

1.2.1 噬菌体的分离

将100μL对数期的金黄色葡萄球菌加入到5mL双倍浓缩营养肉汤液体培养基中，在上述培养液中加入经过5500r/min离心10min处理的污水5mL，于37℃、120r/min振荡培养过夜，次日取上述培养液6000r/min离心10min弃去沉淀，上清液经过0.22μm的无菌微孔滤膜除菌，得到噬菌体原液。

1.2.2 噬菌体的纯化

采用双层平板法和噬菌斑法进行噬菌体的纯化。具体操作如下：取100μL对数期的宿主菌与100μL噬菌体液加入5mL半固体培养基中，充分混合后倒入固体琼脂平板上制成双层平板，待平板冷凝后，立即将其倒置并于37℃恒温培养。

在上述形成噬菌斑的双层平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，用接种针穿刺目的噬菌斑，将穿刺后带有噬菌体的接种针伸入1mL SM培养液中充分混匀，并于4℃冰箱中静置过夜。次日经漩涡振荡器振荡摇匀后，取噬菌体液进行适当稀释，将100μL对数期金黄色葡萄球菌与100μL噬菌体稀释液加入5mL半固体培养基中充分混匀后制成双层平板，待凝固后倒置，并于37℃恒温箱中培养过夜，重复双层平板纯化操作5次后得到纯噬菌体。

1.3 噬菌体的生理特性

1.3.1 噬菌体的电镜观察

采用磷钨酸负染法，方法如下：取100μL纯化增殖的噬菌体，滴在石蜡片上，将铜网放置于噬菌体液滴上方，5min后将铜网自液滴上取下置于干净的滤纸上，晾干5min，使用2%的磷钨酸(pH6.8)染色，10min后将铜网自磷钨酸液滴上取下，晾干，将制备好的染色片在透射电镜下进行观察。

1.3.2 噬菌体热稳定性实验

取400μL 1.14×108PFU/mL的噬菌体于无菌EP管中，分别于40、50、60、70、80℃的水浴中作用20、40、60min。待作用结束后立即将样品置于4℃冷却，将样品进行适当梯度稀释后测定噬菌体的效价。

1.3.3 噬菌体pH值稳定性

噬菌体pH值稳定性实验所选取的pH值梯度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。分别取900μL不同pH值的无菌营养肉汤液体培养基到无菌EP管中，37℃水浴处理，当温度平衡后加入100μL的噬菌体，37℃水浴作用2h，利用双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.4 噬菌体的最佳感染复数(MOI值)的测定

按照感染复数分别为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例，将噬菌体与金黄色葡萄球菌加入营养肉汤液体培养基中，37℃振荡培养10h，4000r/min离心15min以弃去宿主菌沉淀，上清液用0.22μm的滤膜过滤，测定此时噬菌体的效价，所对应的效价最高的感染复数即为最佳感染复数。

1.3.5 噬菌体一步生长曲线的测定

一步生长曲线的测定采用由杜崇涛[10]、Lu[11]等改进的方法。将纯化的噬菌体和对数生长期的金黄色葡萄球菌按照最佳感染复数为0.1的比例加入到液体培养基中，37℃孵育10min，12000r/min离心30s，弃上清，用营养肉汤液体培养基洗涤两次，以去除未吸附宿主菌的游离噬菌体。然后加入37℃预热的营养肉汤液体培养基并充分混匀，迅速置于37℃、150r/min振荡培养，同时开始计时，在0时刻和160min之间，每隔10min取样测定噬菌体的效价。最后以噬菌体侵染宿主菌的作用时间为横坐标，噬菌体的效价为纵坐标，绘制噬菌体的一步生长曲线。

1.4 噬菌体在牛奶中的抑菌应用实验

1.4.1 噬菌体37℃抑菌

参照Martínez等[12]的方法。将培养至对数期的金黄色葡萄球菌，用生理盐水将其浓度调整为2×107CFU/mL和1×104CFU/mL。每个浓度下金黄色葡萄球菌的抑菌实验分为两组进行，其中一组为实验组：取1mL菌液加入到94mL经过巴氏杀菌的牛奶中，同时加入5mL(效价增殖至5×109PFU/mL)纯化的噬菌体液，将其充分混匀；另一组为对照组：取1mL菌液加入99mL巴氏杀菌牛奶中，不添加噬菌体，充分混匀；将以上两种经过处理的牛奶静置于37℃恒温水浴作用，分别于0、1、2、3、6、9、12h取出按照GB 4789.10—2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》中的Baird-Parker平板计数法检测牛奶中金黄色葡萄球菌的数量，从而检测噬菌体的抑菌效果。

1.4.2 噬菌体4℃抑菌

噬菌体抑菌实验处理方法同1.4.1节所述，将经过处理的巴氏杀菌牛奶充分混匀后，置于4℃恒温作用，分别于0、12、24、48、72h检测噬菌体的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 噬菌体的分离纯化

从青岛市团岛污水处理厂分离出一株以金黄色葡萄球菌为宿主菌的噬菌体，通过双层平板可以观察到噬菌斑，经过5次纯化后，该噬菌体所形成的噬菌斑形态和大小保持均匀一致，呈圆形透明，边缘清晰，直径约为1mm，并将该纯化的噬菌体命名为qdsa001(图1)。

图 1 噬菌体qdsa001的噬菌斑Fig.1 Bacteriophage plaque of qdsa001

2.2 噬菌体的生理特性

2.2.1 噬菌体电镜观察结果

图 2 噬菌体qdsa001电镜图Fig.2 TEM micrograph of qdsa001

噬菌体qdsa001增殖液经过透射电镜观察，其形态如图2所示。该金黄色葡萄球菌噬菌体为典型的T系列噬菌体，呈蝌蚪形，头部为正多面体结构，有细长的尾部，噬菌体整个长约为220nm，头部直径为41nm左右，尾部长约180nm左右。根据2005年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第八次报告所提出的分类准则[13]，本研究所分离的噬菌体的形态符合长尾噬菌体科(Siphoviridae)特征，为长尾噬菌体。

2.2.2 噬菌体的热稳定性

图 3 噬菌体的热稳定性Fig.3 Thermal stability of qdsa001

由图3可知，噬菌体在40℃作用60min后活性基本保持不变，在50℃作用60min后噬菌体的存活率仍高达97.8%，噬菌体在60℃条件下作用40min后，其存活率仍在50%以上。因此，噬菌体在60℃条件下，仍具有较为良好的耐受性。在70℃和80℃作用下，则检测不到噬菌体的存在，表明噬菌体基本失活。由此可见该噬菌体对60℃及其以下的温度均具有较强的稳定性。

2.2.3 噬菌体的pH值稳定性

图 4 噬菌体的pH值稳定性Fig.4 pH stability of qdsa001

由图4可知，噬菌体在pH5～9范围内，其效价均在108PFU/mL以上，具有稳定和良好的裂解活性。随着pH值的降低，噬菌体活性显著下降，当pH值为3时，完全失去感染宿主的能力，但其在高pH值环境下有较好的稳定性。pH值为13时仍保持45.8%的存活率。分析表明，该噬菌体具有畏酸嗜碱的特性。

2.2.4 噬菌体最佳MOI值的测定

由表1噬菌体感染复数的结果可知，当感染复数为0.1时，噬菌体感染宿主菌后产生子代噬菌体的效价最高，为3.5×108PFU/mL，因此，可以确定噬菌体的最佳感染复数是0.1。

表 1 噬菌体最佳感染复数 Table 1 Optimal MOI of qdsa 001

2.2.5 噬菌体一步生长曲线的测定

图 5 噬菌体qdsa001一步生长曲线Fig.5 One-step growth curve of qdsa001

由图5噬菌体的一步生长曲线可知，噬菌体qdsa001感染宿主菌后的10min内，噬菌体的数量几乎保持不变，表明噬菌体qdsa001感染宿主菌的潜伏期约为10min；噬菌体侵染宿主菌后的10～100min内，噬菌体的数量急速增加，可知噬菌体qdsa001的爆发期约90min，在随后的60min内，噬菌体的数量变化不大，标志着噬菌体进入稳定期。根据裂解量计算公式：裂解量=爆发末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度[14]，得出该噬菌体的平均裂解量为32.2。

2.3 不同温度条件下，噬菌体在牛奶中的抑菌效果

2.3.1 37℃条件下抑菌效果

图 6 噬菌体qdsa001在37℃巴氏杀菌牛奶中的抑菌效果Fig.6 Inactivation of Staphylococcus aureus in milk by qdsa001 at 37 ℃

噬菌体qdsa001在37℃条件下对牛奶中金黄色葡萄球菌的抑菌作用效果，如图6所示，当初始宿主菌为105CFU/mL时，对照组宿主菌数量呈现上升趋势，在6h之后基本保持稳定；相比对照组，实验组中宿主菌数量则呈现显著的下降趋势，作用6h，实验组中宿主菌数量降至3.5(lg(CFU/mL))左右，至12h，实验组中宿主菌数量已降低至检测限以下。当初始宿主菌数量为102CFU/mL时，对照组的宿主菌数量呈现上升趋势，作用12h后增至107CFU/mL；而实验组在噬菌体作用下则呈现下降趋势，作用12h后，牛奶中宿主菌数量降至检测限以下。因此，噬菌体对牛奶中两个不同浓度金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显。

2.3.2 4℃条件下抑菌效果

图 7 噬菌体qdsa001在4℃巴氏杀菌牛奶中的抑菌效果Fig.7 Inactivation of Staphylococcus aureus in milk by qdsa001 at 4 ℃

由图7可知，当初始宿主菌数量为105CFU/mL时，对照组中宿主菌数量随着时间的增加，几乎无变化；实验组宿主菌数量呈现显著地下降趋势，作用24h后，实验组中宿主菌的数量降至103CFU/mL以下，至72h时降至9CFU/mL。当牛奶中加入初始宿主菌数量为102CFU/mL时，对照组中宿主菌数量无显著变化，而加入噬菌体的实验组则呈现下降趋势，作用48h后，与对照组相比宿主菌数量下降约1.5(lg(CFU/mL))，作用72h后宿主菌数量降低至检测限以下，表明在4℃条件下，噬菌体对牛奶中两个不同浓度金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显。

3 讨 论

金黄色葡萄球菌为最主要的食源性病原菌之一。然而，噬菌体作为一种生物抑菌剂，具有突出的优越性，广泛存在于自然界中，在生物圈中其数量达1031之巨[15]。同时，具有特异杀菌、不易产生抗性等特点。因此，噬菌体对于食品中金黄色葡萄球菌的生物防控具有良好的应用前景。国内对金黄色葡萄球菌噬菌体已有研究，石琰璟等[16]从污水中分离和纯化了以金黄色葡萄球菌为宿主菌的噬菌体，但是未涉及其生物学性质的研究。李陇平等[17]也只是探讨了金黄色葡萄球菌噬菌体的分离纯化以及保存方面的研究，也并未涉及其相关生物学性质的深入研究。本研究分离纯化出一株以金黄色葡萄球菌为宿主菌的噬菌体，并对其基本理化和生物学特性进行了分析研究。同时，利用纯化好的噬菌体qdsa001对巴氏杀菌牛奶进行抑菌效果的研究。

利用噬菌体进行食品中的生物防控已经有所报道。本实验所分离得到的噬菌体qdsa001对温度和pH值均具有较为良好的耐受能力，使其应用于食品工业具有良好的基础。特别是，调查已经表明金黄色葡萄球菌是牛奶中的主要致病菌[18]。因此，利用噬菌体抑制牛奶中的金黄色葡萄球菌，对乳制品的发展具有十分重要的意义。根据实际生产情况，本研究中选取牛奶加工贮运过程中的关键控制温度37℃和4℃为研究条件，分别测定噬菌体qdsa001对牛奶中105CFU/mL与102CFU/mL的两个不同浓度金黄色葡萄球菌的抑制作用，结果表明，噬菌体qdsa001表现出良好的抑菌能力，37℃作用12h后，不同浓度金黄色葡萄球菌的牛奶中宿主菌数量均降至检测限以下；4℃条件下，噬菌体也表现出良好的抑菌性能，特别是对于初始菌落数为102CFU/mL的牛奶，在72h内，可将牛奶中宿主菌数量降至检测限以下，符合国家对于牛奶中金黄色葡萄球菌的限量要求。综上所述，本实验所分离的噬菌体qdsa001用于生物防控是切实可行的，特别是对于牛奶在贮运和生产加工过程的金黄色葡萄球菌的控制具有重要意义。因此，本研究为利用噬菌体进行食品中的生物防控提供了初步的实验依据。

[1] PESAVENTO G, DUCCI B, COMODO N, et al. Antimicrobial resistance profile of Staphylococcus aureus isolated from raw meat： a research for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA)[J]. Food Control, 2007, 18(3)： 196-200.

[2] GUPTA R, PRASAD Y. P-27/HP endolysin as antibacterial agent for antibiotic resistant Staphylococcus aureus of human infections[J]. Current Microbiology, 2011, 63(1)： 39-45.

[3] LOWY F D. Staphylococcal aureus infections[J]. N Engl J Med, 1998, 339： 520-532.

[4] 刘秀梅. 食源性疾病监控技术的研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2004, 16(1)： 3-9.

[5] 巢国祥, 焦新安, 周丽萍, 等. 食源性金黄色葡萄球菌流行特征、产肠毒素特性及耐药性研[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(8)： 904-907.

[6] 黄冰, 邓志爱, 谭铭雄, 等. 食品中金黄色葡萄球菌污染状况、产肠毒素特性及耐药性研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2009, 19(6)： 1380-1382.

[7] HAGENS S, LOESSNER M J. Bacteriophage for biocontrol of foodborne pathogens： calculations and considerations[J]. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11(1)： 58-68.

[8] 刘伟, 王学琴, 董世雷, 等. 噬菌体及其内溶素的应用研究进展[J]. 浙江农业学报, 2010, 22(5)： 702-708.

[9] CARLTON R M, NOORDMAN W H, BISWAS B, et al. Bacteriophage P100 for control of Listeria monocytogenes in foods： genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study, and application[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2005, 43(3)： 301-312.

[10] 杜崇涛. 大肠杆菌O157噬菌体的分离鉴定及其初步应用[D]. 长春： 吉林大学, 2008.

[11] LU Z, BREIDT F J, FLEMING H P. Isolation and characterization of a Lactobacillus plantarum bacteriophage ΦJL21 from a cucumber fermentation[J]. Food Microbiol, 2003, 84(2)： 225-235.

[12] MARTÍNEZ B, OBESO J M, RODRÍGUEZ A, et al. Nisinbacteriophage crossresistance in Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 122(3)： 253-258.

[13] 洪健, 周雪平. ICTV第八次报告的最新病毒分类系统[J]. 中国病毒学, 2006, 21(1)： 84-96.

[14] 于龙, 温占波, 杨文慧, 等. 一株粘质沙雷氏菌烈性噬菌体污水分离及特性[J]. 微生物学报, 2008, 48(4)： 498-502.

[15] HENDRIX R W. Bacteriophage genomics[J]. Curr Opin Microbiol, 2003, 6(5)： 506-511.

[16] 石琰璟, 郭清吉, 葛晓萍, 等. 金黄色葡萄球菌噬菌体的分离纯化[J]. 青岛科技大学学报, 2007, 28(3)： 205-207.

[17] 李陇平, 张智英. 金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的分离鉴定和最佳保存方法研究[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(6)： 141-146.

[18] 李波. 原料奶中病原菌的调查及代表性病原菌的研究[J]. 食品工程, 2007(3)： 3-6.