细菌漆酶的研究及应用进展

马莹莹 贾红华 韦萍

（南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816）

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是含铜的多酚氧化酶（polyphenol oxidases，PPO），能通过O2作为电子传递介质氧化多种酚类化合物，生成苯醌和水。因其与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白在结构和功能上存在着许多相似之处，故同属于蓝色多铜氧化酶家族。

漆酶按照来源分为3大类：植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。最早发现的漆酶就属于植物漆酶的一种——漆树漆酶。尽管漆酶大量存在于植物中，但植物漆酶并未被广泛应用，主要是因为天然植物提取物包含大量的氧化酶类，植物漆酶很难被检测和纯化。目前研究和应用的最广泛的是担子菌亚门（Basidiomycotina），尤其是白腐真菌所分泌的漆酶。除此之外，还有子囊菌亚门（Ascomycotina）及半知菌亚门（Deuteromycotina）。

近年来的研究发现，漆酶也同样广泛存在于细菌中。由于与真菌漆酶结构不同，细菌漆酶在Cu2+抗性、糖基化、热稳定性和酶的最适pH范围广等方面比真菌漆酶更有优势［1］。

随着分子生物学技术和结构生物学方向的快速发展，对细菌漆酶的认识也逐渐深入。由于其与真菌漆酶相比，结构更加简单，有望更容易大规模生产，从而推动其应用。

1 细菌漆酶的生产

1.1 细菌漆酶的来源

1993年，Givaudan［2］在生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）中发现了漆酶活性。该细菌漆酶是由一个催化亚基和1或2条长链所组成的多聚体酶类，它在细胞色素形成中扮演着重要的角色，而且能催化利用植物酚类物质，充当电子传递者。

Solano等［3］从产黑色素细菌海单胞菌中分离得到两种不同的PPO，试验发现其作用底物跟络氨酸酶和漆酶的底物特异性一致。Mellano和Cooksey［4］从假单胞菌（Pseudomonas syringae）中分离得到一种漆酶类似物——CopA；Brown等［5］从大肠杆菌（Escherichia coli）中发现了PcoA。这两种漆酶类似物在结构上与多铜氧化酶同源，并表现出Cu2+抗性。

2003年，Endo等［6］将从链霉菌中得到的EpoA在物理化学和生物化学两个方面进行了表征，而且构建了重组子rEpoA在大肠杆菌中表达。其同源三聚体相对分子量为114 kD，底物专一性相对比较窄，它不能氧化多种漆酶模式底物，如愈创木酚、丁香醛连氮。

随后，黄俊等［7］报道Klebsiella细菌菌株具有漆酶活性。试验验证，该细菌漆酶经60℃处理或pH 10条件下透析20 h仍能保持一定的酶活。

2010年，Tamaki等［8］在溶杆菌属菌株T-15中发现了一种能氧化尿酸的酶。该酶由592个氨基酸组成，含有4个相同的铜离子结合位点，而且每个亚基中含有3个铜离子。该酶的一级结构与海单胞菌的多酚氧化酶有33%的一致性。

目前，研究得最透彻的细菌漆酶是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）芽孢外衣蛋白CotA。其结构与多铜氧化酶相似，具有抗紫外和H2O2氧化的动能。因为芽孢的特殊构造，CotA具有极好的温度耐受性，在80℃下的半衰期为2 h，其最适温度为75℃。2010年，Mao等［9］利用功能筛选的方法，从红树林环境中筛选出一个表达产物具有漆酶活性的新基因Lac591，其基因序列全长1 500 bp；Lac591有4个作为铜离子结合位点的组氨酸保守区域，且该基因与嗜碱芽孢杆菌（Bacillus halodurans C-125）的漆酶相比同源性为52%。该酶在pH7.0-10.0范围内仍能保留大于80%的酶活（愈创木酚为底物），最适反应温度为55℃。

2011年，Fang等［10］从海洋微生物中获得一段大小为1.32 kb的细菌漆酶基因，命名为Lac15。Lac15有439个氨基酸，含有3个保守的Cu2+结合区域。Lac15在pH5.5-9.0和温度15-45℃下能保持稳定的活性。与真菌漆酶相比，Lac15具有极好的氯化物耐受性；在氯化物浓度不高于700 mmol/L时，Lac15的活性提高了2倍，甚至在氯化物浓度为1 000 mmol/L时也能保持正常的活性。

此外，嗜热菌中的超嗜热菌（Aquifex aeolicus）、嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）中也有报道存在漆酶活性。

1.2 细菌漆酶的生产

与其他催化剂相比，酶的生产成本往往比较高，通过优化培养基条件提高酶产量是重要的降低生产成本的可行性方法，主要通过碳源和氮源的选择达到提高细菌漆酶产量目的。

Jing等［40］对淡紫灰链霉菌通过液体发酵培养基的优化能同时提高漆酶和木质素过氧化酶的产量。结果发现，培养基中C/N的摩尔比是提高漆酶产量的关键因素，当其在1.43-1.48之间时，漆酶酶活最高能达到0.107 4 U/mL。

Niladevi等［41］利用稻草对沙链霉菌进行固体发酵产漆酶的研究发现，与咖啡浆相比，稻草更适合于漆酶的生产。最优条件下其漆酶酶活能达到55.4 U/g。

谢迎春等［42］从抗生素链霉菌中提取目的基因phs，利用pET-28a（+）质粒作为载体，以E.coli为表达宿主高效表达吩恶嗪酮合成酶（PHS）。通过对各种可能影响表达的因素进行研究发现，当培养基pH7.0、Cu2+浓度1.5 mmol/L、诱导温度30℃、IPTG诱导浓度1 mmol/L、菌体生长密度OD600达到0.6时，加入IPTG诱导16 h产PHS量最高，能达到7 U/mL。

2 细菌漆酶的结构

细菌漆酶属于糖蛋白，一般以单体蛋白的形式存在。不同来源的细菌漆酶其相对分子量差异很大，其糖基化的程度也不一样。细菌漆酶一般由几种同工酶或亚基组成，如生脂固氮螺菌就是由3个亚基组成。

Katz等在抗生素链霉菌（Streptomyces antibioticus）的细胞抽提物中发现一种具有漆酶活性的物质，即吩恶嗪酮合成酶（Phenoxazinone synthase，PHS）。PHS 是一种球状蛋白，每个蛋白亚基大小为 75 × 60 × 50 Å3。PHS结构一般分为 3个结构域：结构域一含有9个β股，结构域二含有 11 个，结构域三包含2个短的螺旋片段。PHS 的 3D 结构与其他两种多铜氧化酶（CotA和 CueO）类似，只是 PHS 含有612氨基酸，相对而言，其他两种则较小，分别为 513和488 个氨基酸序列。Alex等用分辨率达2.30 Å的X-射线衍射仪对PHS晶体结构进行了成功的解析，并发现一些特殊的特征［43］。其结构形成了一个六聚的环，外径为185 Å，中心有一个直径为50 Å的大空腔。六聚体亚基含有5个铜离子和3类铜结合域，其中第5个铜离子为PHS所特有的，它位于结构域2和结构域3的连接区域。其结构如图1所示。

表1 已报道的细菌漆酶和漆酶类似物

单核的Ⅰ型铜离子位于结构域三，与2个His的N和1个Cys的S配位结合，其中共价键 Cu-Scys使酶呈现蓝色。Ⅱ型Cu和Ⅲ型Cu形成的三核中心位于结构域一和结构域三的界面上，该三核中心与高度保守的4个 His-X-His花样的8个His配位结合。Ⅲ型Cu结合6个，并且原子对之间还有氧桥，具有强反磁性，导致其对电子顺磁共振效应（EPR）的消失。Ⅱ型结合2个。第3个结构域除了有 β-sandwich，还有4个端得螺旋区，最后一个螺旋位于C-末端，由结构域一的Cys85和结构域二的Cys48形成的二硫键来稳定。第2对二硫键（Cys117-Cys204）存在于结构域一和结构域二之间。

3 固定化酶

由于天然漆酶在工业应用中容易失活，所以导致成本高，大大限制了其应用。因此，提高漆酶的稳定性和重复使用次数显得极为重要。

图 1 PHS铜离子结构图

漆酶固定化技术作为一种常用的酶改造方法，近年有一些报道。Niladevi等［44］利用海藻酸铜成功固定了S. psammoticus 所产多铜氧化酶，通过8批次连续脱除苯酚反应，固定化多铜氧化酶保持了较好的稳定性。Singh等［45］将γ-proteobacterium JB所产漆酶固定到硝化纤维薄膜上，在4-30℃条件下能稳定保持100%酶活3个月。研究证明，固定化方法能有效提高漆酶的稳定性和利用效率，其反应产物也更易于纯化。

磁性高分子微球是近年来发展起来的一种新型高分子材料，是指内部含有磁性金属或者金属化氧化物，具有磁响应性的超细粉末。王颖等发明了一种用磁性复合微球固定化漆酶的方法，该方法是以金属螯合的磁性复合微球为载体，通过配位键结合作用将漆酶固定在载体上。载体制备是先利用化学沉淀法合成磁性四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子，以该纳米粒子为核，利用溶胶-凝胶法制得核壳式磁性二氧化硅（SiO2），再以γ-氯丙基三甲氧基硅烷为媒介，在磁性二氧化硅表面接枝一种含羰基或氨基的聚合物，然后通过螯合一种过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+）利用金属螯合配体与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用，将漆酶固定在该载体上。该方法制备的固定化漆酶跟一般方法比较起来具有快速磁响应性能。

4 细菌漆酶的应用

4.1 染料废水

近来染料与印染工业的迅猛发展，随之而来的染料的种类和数量也迅速增加。据美国《染料引索》报道称，目前商品染料种类已达几万种，年生产量超过7×105t。人工合成的染料通常含有复杂的芳香环结构、品种繁多、化学稳定性高、生物可降解性低，且多数染料及其代谢中间产物具有致突变性、致癌性和其他毒性，这也是染料成为重要的环境污染物的原因之一。

漆酶催化空气中的氧气直接氧化分解各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚A及芳香胺等，在漆酶介导剂（HBT、ABTS等）存在的情况下，漆酶还可以催化降解与木质素相关的二苯基甲烷、N- 取代对苯基二胺、有机磷化合物（农药）、二噁英、偶氮类和靛青类染料。用漆酶厌氧处理废水，可除去废水中的木质素衍生物、单宁、酚醛化合物等有毒物质。

叶茂等［46］研究发现，重组漆酶Lac591在金属离子Ca2+和小分子介质（ABTS或HBT）存在下，处理染料14 h降解率能达到11%（碱性蓝3）、25%（亚甲基蓝）、57%（溴酚蓝）、60%（结晶紫）、37%（亮蓝R）和10%（酸性紫7）。对靛红染料Lac591处理60 min，其降解率即可达到100%。此外，该酶处理碱木质素14 h后，其降解率也可达11%。

Held等［47］利用矾土固定Bacillus SF的芽孢外衣漆酶进行染料脱色。固定化芽孢漆酶蛋白在60℃的半衰期为66-80 h，特别是在碱性条件下，与真菌漆酶相比，细菌漆酶的热稳定性极高。在pH9.5的条件下，固定化Bacillus SF芽孢漆酶蛋白的半衰期为67 h，利用固定化细菌漆酶对纺织染料进行脱色，60℃处理90 min 后，脱色率达99%。

4.2 电化学领域

漆酶在催化底物的同时，氧分子一步4个电子被还原生成水，在生物电子设备的研制中成为理想的生物电极阴极催化剂。如检测化学物质的生物传感器、体内医疗设备供电的植入式生物燃料电池、疾病诊断等。漆酶电化学研究具有十分重要的意义，除能快速灵敏地检测化学物质，在研究氧化还原蛋白质的荷电界面空间取向的同时，还能有助于人们了解蛋白质大分子的结构与理化性质的关系，以及蛋白质在生命体内的代谢机制和生理作用。

Beneyton等［48］首次将cotA固定到玻璃碳电极上，制备成生物燃料电池。其电流的大小是直接跟cotA的催化效率（kcat/Km）相关的。经cotA修饰后的电极最适反应温度是45-50℃，而且能保持稳定的催化活性至少7周。

4.3 造纸

造纸工业中，传统的化学制浆最大的缺陷是木质素去除不彻底，而且残留的木质素会使纸张变成褐色，所以之后还要进行漂白；而传统的氯法漂白产生的废水不但污染环境，而且漂白后的纸张极易反弹。

利用漆酶进行生物漂白不仅能避免环境问题，还能提高纸张的质量和强度。但是漆酶的氧化还原电位比较低，不能降解木质素结构中90%的非酚型结构单元。因此，还需要加入一些小分子化合物作为介导剂起到传递电子的作用。研究指出，一些带有N-OH基团的N-杂环物，如1-羟基苯并三唑（HBT）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、紫尿酸（VIO）和N-羟基乙酰苯胺（NHA）等均为良好的小分子介质。

首次细菌漆酶应用于造纸工业中是2003年Arias等［49］利用S.cyaneus CECT3335所产漆酶，以ABTS为小分子介质，降解桉树中的木质素，与真菌漆酶相比，其降解效率提高了18.4%。最近，γ- proteobacterium JB所产漆酶也成功应用于纸浆的生物降解中［50］。在最优条件下，同样是以ABTS为小分子介质，纸浆的澄清度能提高5.89%，卡伯值降低21.1%。

5 小结

现阶段，由于细菌漆酶在各方面的应用使得人们对它的关注度越来越高，但对其研究还远远不够，尤其国内关于细菌漆酶的报道很少。细菌漆酶的分子结构和催化机理、如何通过物理和化学等手段进一步提高细菌漆酶的利用率还有待深入研究。今后可以考虑在以下几个方面进行研究：第一，细菌漆酶的分子结构，以及不同细菌漆酶间不同的催化机制，为高活性细菌漆酶在蛋白质水平上改造提供依据；第二，筛选更高产漆酶的野生菌株，优化细菌漆酶的生产，为其工业化应用打下基础；第三，尝试更多的固定化载体固定细菌漆酶，减少酶活损失的同时能最大限度保持酶的活性。

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