支原体脂蛋白及其变异与宿主互作研究进展

倪博 白方方 刘茂军 冯志新 熊祺琰 魏建忠 邵国青

（1.江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

支原体是简单的可自我复制的最小生物体，基因组简单，缺乏某些代谢途径。支原体的种类较多，有80多个种属［1］，很多都可以感染人和动物，造成慢性感染性疾病，一般不致死。除少数支原体可胞内寄生外，绝大部分支原体以胞外寄生方式生活，一般主要寄生于宿主的呼吸道及泌尿生殖道。支原体没有细胞壁，仅有一层细胞膜将胞质和外界相隔离，胞膜中含有丰富的脂蛋白，称为脂质相关膜蛋白（lipid associated membrane proteins，LAMPs），具有疏水性，可特异性的溶于Triton X-114［4］。大部分支原体脂蛋白都暴露在外，一些脂蛋白的功能与革兰氏阴性菌的胞浆蛋白相同，具有毒力作用或者是抗体的作用靶位［5，6］。脂蛋白是一类含有脂质的膜蛋白，N端含有二酰/三酰甘油半胱氨酸结构，由此锚定于宿主细胞膜上，具有抗原性，并能以高频率发生相位、抗原变异，形成多样化的支原体表面。

许多编码脂蛋白的基因包含在ABC转运蛋白的操纵子内，ABC转运蛋白涉及营养摄取、细胞黏附及ATP的分解。如人型支原体（Mycoplasma hominis）的特征性ABC转运蛋白家族脂蛋白OppA［7］是一种短肽聚合蛋白，有黏附性，具有强ATP酶活性，并且可以诱导细胞凋亡［8］。鸡毒支原体（M.gallisepticum）的MslA是一种具有免疫原性的脂蛋白，有毒力作用，在强弱毒株中的表达不同［5］。

随着分子生物学的发展，人们利用基因组学和蛋白质组学技术对支原体有了更深的了解［2，3］，但是支原体的毒力和致病机制还尚未阐明。近几年，越来越多的研究指出支原体的脂蛋白在其致病机制中发挥了重要作用。

1 支原体脂蛋白在免疫反应中发挥重要作用

支原体膜中丰富的脂蛋白，在天然免疫和感染初期有重要作用［9］。Toll样受体（toll-like receptor，TLR）1、2和6是脂蛋白的受体，在免疫反应中介导各种重要通路的活化［10］。脂蛋白可以通过多种机制与宿主发生作用并引发宿主细胞损伤，如脂蛋白可以刺激细胞产生前炎性因子、细胞因子、NO等；下调炎症反应，使宿主没有表现出明显的临床特征；逃避宿主免疫系统的监视，使其能在宿主细胞中长期生存；具有细胞毒性，可以使宿主细胞发生坏死或凋亡；在艾滋病的发病过程中起辅助或促进的作用等。

1.1 支原体脂蛋白致炎性反应

由于缺乏N-酰基转移酶，大部分支原体脂蛋白是双酰基的，支原体脂蛋白的这种特殊结构可以强烈刺激巨噬细胞［10］。近期发现，生殖支原体（M. genitalium）中也存在三酰基脂蛋白MG149，同样可以通过TLR1和TLR2介导激活NF-κB引起炎症反应［11］。在低-GC含量革兰氏阳性菌和支原体中还发现一种新型结构的脂蛋白，共两种形式，一种含有N-酰基-S-单酰基-丙三基-半胱氨酸，被命名为lyso结构，通过TLR2/6受体可以诱导前炎症因子的产生；另一种脂蛋白含有特殊酰基，称为N-乙酰基脂蛋白，同样可以诱导前炎症因子产生［12］。

猪肺炎支原体作用于小鼠巨噬细胞MH-S和RAW264.7，可以引发MAPK（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号转导通路的三级激酶级联反应，其中MAPK的3个信号转导通路均被激活，包括细胞外调节蛋白激酶ERK（extracellular signalregulated kinases，ERK）通路、p38通路及JNK/SAPK（Jun N-terminal kinases/stress-activated protein，JNK/SAPK）通路，产生一系列活化传递信号［13］。此外，还激活NF-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路，诱导细胞大量产生NO、细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）及TNF-α、IL-1β和IL-6［14］。这些炎性产物可以间接促进细胞发生凋亡。

1.2 支原体脂蛋白诱导细胞凋亡

支原体脂蛋白诱发细胞凋亡首次发现于发酵支原体（M. fermentans）。发酵支原体的脂蛋白通过TLR2可以介导淋巴细胞、单核巨噬细胞发生凋亡，其中caspase-3和caspase-8起重要的调节作用［15］。随后发现TLR6受体同样可以介导细胞凋亡，并可以激活核因子NF-κB，其中涉及髓样分化因子MyD88（myeloid differentiation factor88）与Fas相关死亡域蛋白FADD（Fas-associated with death domain protein）［16］。这其中促分裂素原活化蛋白激酶p38 MAPK及上游的细胞凋亡信号调节激酶ASK1（apoptosis signal-regulating kinase 1）激活下游通路的核因子NF-κB和转录因子激活蛋白AP-1（activating protein-1）［17］。

此外，生殖支原体的脂蛋白LPS可以刺激人单核细胞THP-1产生炎性细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6，并激活NF-κB诱导细胞发生凋亡［18］。穿透支原体LAMPs可以通过激活NF-κB诱导小鼠巨噬细胞发生凋亡［19］。支原体脂蛋白的这种致凋亡能力很可能是支原体致病性的重要组成部分。

本研究发现，猪肺炎支原体的LAMPs可以引起猪肺泡上皮细胞SJPL及猪肺泡巨噬细胞3D4-21发生凋亡，可以观察到细胞染色体皱缩，并产生凋亡小体，还需进一步检测凋亡通路相关指标，以此来确定LAMPs致凋亡的机制。

2 支原体脂蛋白的变异

由于支原体采取寄生方式生活，它们需要躲避或是破坏宿主的免疫防御系统来适应宿主。支原体的基因组中存在很多编码脂蛋白的基因家族及相关的变异调控机制，通过随机的发生相位-抗原变异，形成多样化的支原体表面，以此来躲避宿主免疫［20］。主要变异机制有ON/OFF分子开关、大小变异、结构重组及基因水平转移等（表1）。

表 1 调控支原体表面相位-抗原变异的主要机制

2.1 ON/OFF分子开关

目前已发现3种影响关键基因表达的ON/OFF分子开关。一种是天然变异，在基因易变区内插入或删除核苷酸，发生DNA滑链。如猪鼻支原体vlp基因，只有当启动子部分的poly A长度为17 bp时，下游vlp基因才开始翻译，插入或者删除任一核苷酸都导致翻译的停止［21］。第二种方式是重组变异，通过识别特殊位点的重组酶进行DNA重组。如牛支原体（M.bovis）、肺炎支原体和无乳支原体（M.agalactiae）的vsp，vsa和vpma基因都含有一个特异位点重组酶，由这个重组酶代替原先的有效启动子［22-24］。

此外，还有一种基于启动子倒置的基因重组，如穿透支原体的mlp基因通过倒置启动子启动ON/OFF开关的表达［25］。

2.2 大小变异

无乳支原体5 632株理论上可表达91种不同的Vpma表面结构［24］，标准株PG2仅能表达6种。通过插入或删除重复序列所引起的vpma大小变异可以改变支原体表面结构。

2.3 结构重组

最近，人们在鸡滑液支原体（M.synoviae）和生殖支原体中发现第3种基因变异机制-结构重组，变异的频率更高。滑液支原体vlhA家族由单个vlhA基因和一些缺少5'末端序列的假基因组成。vlhA功能片段与假基因、假基因的复制产物以及所表达的各种缺失片段之间发生重组，形成大量变异的抗原［26］。生殖支原体的基因组中包含多个MgPar重复区域，其中MgPar域与mgpB、mgpC为同源体，mgpB、mgpC编码具有免疫原性的黏附蛋白，mgpB、mgpC及MgPar之间的重组，可以产生高频率的抗原变异［27］。

2.4 基因水平转移

随着越来越多全基因组序列的获得，人们发现，在支原体之间存在大量基因水平转移（horizontal gene transfer，HGT）［28］。基因水平转移是指在不同的生物个体之间，或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交换，是相对于垂直基因转移（亲代到子代）而提出的。首次在鸡滑液支原体和鸡毒支原体之间发现，这两个菌株的亲缘关系较远，但编码血凝素的基因可以从鸡毒支原体基因组平移到鸡滑液支原体的基因组中。将两个支原体的全基因组进行对比，发现滑液支原体中也有大量基因家族发生水平基因转移至鸡毒支原体，发生转移的包括血凝素基因家族，ABC转运蛋白操纵子，信号肽酶I，唾液酶基因和甘油3磷酸脱氢酶基因［29］。

在许多支原体基因组中都存在完整的或部分的基因转座酶接合元件ICEs（integrative conjugal elements，ICEs）［无乳支原体、牛支原体、山羊支原体（M.capricolum）、结膜支原体（M.conjunctivae）、发酵支原体、肺炎支原体、丝状支原体（M. mycoides）］，这个接合部位很可能是基因水平转移的通道［30］。

感染同一宿主的不同支原体之间可能会发生基因交换，由于转移的大部分基因都是编码膜蛋白和脂蛋白的序列，基因水平转移可能是支原体获得毒力、致病力的重要途径［31］。

2.5 支原体抗原调节

在运动支原体（M.mobile）的脂蛋白中出现了一种新的表面变异-支原体抗原调节（Mycoplasmal antigen modulation）［32］。运动支原体的脂蛋白Mvsps可发生相位变异和抗原变异。有研究表明，Mvsps和抗体间的结合是特异的，由抗体结合引起的Mvsps减少，证明存在一种新型的支原体表面变异，该研究将之称为“支原体抗原调节”。

3 支原体脂蛋白变异对支原体的影响

3.1 支原体脂蛋白变异对细胞黏附的影响

支原体的致病机理复杂，包括引起疾病的发生和影响整个宿主健康状况两个方面。脂蛋白介导的黏附在其致病机理中发挥重要作用，其中肺炎支原体的末端结构黏附最为典型［33］。肺炎支原体Vsa蛋白是一个可发生大小-相位变异的脂蛋白家族，在补体反应中是肺炎支原体的防护盾，并且可以促进肺炎支原体黏附于非生物膜上。有研究指出表达长串重复的Vsa的支原体对小鼠MLE-12细胞的黏附性较弱，而表达短Vsa的黏附性强［34］。

3.2 支原体脂蛋白变异对免疫调节的影响

鼠肺炎支原体（M. pilmonis）的表面脂蛋白Vsa的长度对补体相关免疫反应的敏感性有影响。长Vsa中含有40个重复序列，对补体有抵抗力；短Vsa仅有5个，甚至更少的重复序列，对补体十分敏感。同时，Vsa的大小还可以调节鼠肺炎支原体表面糖蛋白EPS-I的亲和力，表达短Vsa脂蛋白的支原体表面上EPS-I的数量较多，对补体反应敏感。但是本身缺乏EPS-I，同时表达长Vsa脂蛋白的突变体对补体反应也很敏感。因此，EPS-I和Vsa均可调节支原体对补体反应的敏感性［35］。

3.3 支原体脂蛋白变异对细胞生理功能影响

猪鼻支原体是细胞系中常见的污染病原，可以影响细胞正常的新陈代谢。猪鼻支原体的脂蛋白LPP可以通过激活NF-κB通路上调神经瘤细胞SHSY5Y钙蛋白酶抑制蛋白（普遍存在的Ca2+依赖蛋白酶，钙蛋白酶内源性抑制剂）的表达［36］。钙蛋白酶抑制蛋白是细胞内非炎性蛋白，显著影响细胞正常的生理功能。

3.4 支原体脂蛋白变异对致病力的影响

发酵支原体的主要特异性抗原-糖甘油磷脂GGPL-III是一种含胆碱磷酸的氨基糖甘油磷脂，能发生抗原变异［37］。单独的GGPL-III并不致病，但能加剧一些慢性疾病中的炎症反应。GGPL-III可以加重小鼠关节炎和Ni过敏症。发酵支原体的脂蛋白在一些慢性疾病中可能存在重要的致病作用。

4 支原体表面多样化的生物学意义

支原体可变异的蛋白大部分是暴露于表面的脂蛋白，由多基因家族编码，可以引起宿主强烈的免疫反应。通过基因突变和各种基因变化，使支原体形成多样化表面。这些可多样化变异的表面蛋白与宿主间相互作用关系密切，通过修改或除去一些固有元件，迅速的改变支原体表面结构，为支原体提供了一种防御机制。脂蛋白家族通过变异，选择性的调节支原体表面与宿主细胞、环境间的相互作用，帮助支原体躲避宿主的特异性免疫防御［38］。

5 总结

支原体的种类众多，可感染的宿主群也很广泛，即使存在特异性免疫应答，支原体也可引起慢性感染。这些持续性感染说明支原体和宿主间的相互作用远比预想的要复杂的多。由于没有细胞壁，支原体表面的脂蛋白在与宿主的相互作用中发挥了重要作用。

支原体通过一系列精密的基因变化迅速改变膜结构是它们成功寄生于宿主的主要原因。这些复杂的基因变异可以影响支脂蛋白的表达及结构，发生相位变异和抗原变异形成了多样化的支原体表面，帮助支原体躲避宿主的免疫应答，同时这也可能是阻碍疫苗产生保护力的原因之一，导致针对支原体的疫苗在实际生产中效果不佳。

脂蛋白在支原体结构中有重要作用，脂蛋白的结构、性质、相位-抗原变异及水平基因转移等变异，在支原体毒力及致病性中也占有重要作用。对其在支原体毒力、致病性中作用的大小及其作用机制，以及宿主对支原体的变异是否存在选择性作用等未知问题，还需进一步探索。这些领域的进一步研究将有助于阐明支原体的致病机制。

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