蛋白片段互补分析方法及其应用

张洁 柳长柏

（三峡大学分子生物学研究所，宜昌 443002）

蛋白质是生命体的重要组成成分，是细胞活性及功能的最终执行者。蛋白质之间复杂的相互作用决定着生物体的复杂程度。不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质及其功能也不尽相同，因此对蛋白质结构定位及蛋白质之间相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的依据，也可为疾病治疗提供潜在靶点。

迄今，研究蛋白质相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、荧光共振能量转移技术及双分子荧光互补技术等。新近发展起来的蛋白质片段互补分析（protein fragment complementation assay，PCA）技术因为可以在体内外动态地研究蛋白质相互作用而日趋引人注目。PCA是一种高灵敏度，可定量化的，高通量筛选方法，可动态地观察活细胞、器官、甚至个体水平蛋白相互作用，被广泛地应用到药物递送，化学遗传学，蛋白质组学等研究领域［1，2］。

1 PCA原理

所谓PCA是指将某个功能蛋白切成两段（如N端和C端），分别与另外两种目标蛋白相连形成两个融合蛋白。在一个反应体系中，两个目标蛋白的相互作用使得两个功能蛋白质片段相互靠近，互补并重建功能蛋白质的活性，通过检测功能蛋白质的活性来判断目标蛋白质间的相互作用。在PCA体系中，功能蛋白的两个片段可以互补融合成报告蛋白（如酶、荧光蛋白等）。只有两个目标蛋白发生了相互作用，才能使报告蛋白的两个片段相互靠近，重新折叠恢复其天然结构，重构生物活性。图1以荧光蛋白为例说明PCA原理。X、Y和Z为研究目标蛋白，N、C为由报告蛋白的荧光蛋白切割形成的N端和C端片段。（1）目标蛋白X通过连接子与N片段相连，目标蛋白Y通过连接子与C片段相连。如果X和Y不发生相互作用，则荧光蛋白不能重新折叠、重构荧光生物活性；（2）目标蛋白X和Z可发生相互作用，使N片段和C片段重新折叠重构荧光蛋白生物活性。

图1 PCA原理示意图

2 PCA报告蛋白的选择

PCA方法的特征是报告蛋白的互补片段不能自发折叠，只有在目标蛋白发生相互作用后，才促使报告蛋白再折叠恢复生物活性。自发折叠将会导致假阳性信号。报告蛋白互补片段的融合会影响互相作用的蛋白以及检测其相互作用的能力。因此，第一，对于任何一个报告蛋白来说，要确保最佳位点切割不会损害其功能，可通过再折叠形成有功能的融合蛋白；第二，需考虑报告蛋白的定位或者互补片段的鉴定是否影响PCA试验结果［3］。

目前PCA所使用的报告蛋白包括二氢叶酸还原酶［4］（DHFR），β-内酰胺酶［5］（β-lactamase），绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶Gaussia luciferases［6］、Renilla luciferases［7］及Cre重组酶［8］等。其结构分为两部分，单独表达时均无活性，可通过试验检测到最佳切割位点，通过连接子（soft linker）与目标蛋白连接。Remy等［3］在目标蛋白和报告蛋白片段之间使用连接子（Gly.Gly.Gly.Gly.Ser）n发现，该连接子具有很好的灵活性，能有效地使互补片段折叠复性而不影响各个蛋白（片段）的相互作用。

2.1 基于DHFR的PCA

DHFR在真核细胞核苷酸生物合成中起重要作用，催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，细胞缺失DHFR是致死性的，而成为极佳报告蛋白应用于PCA研究。Remy等［9］研究发现，DHFR-PCA有两个层面的检测方法：（1）利用DHFR对细胞生存是必须的特征，通过观察细胞的生长状态来间接反映出两种目标蛋白有无相互作用。其缺点是不能反映出目标蛋白是何时发生作用，作用部位等动态过程；（2）荧光标记的底物甲氨蝶呤只能与完整的DHFR作用才能产生荧光，因而可以动态地反应目标蛋白相互作用发生的时间、位置等。

2.2 基于β-lactamase的PCA

β-内酰胺酶是细菌产生的以β-内酰胺类药物为底物的水解酶。Galarneau等［5］使用TEM-1型 β-lactamase建立了PCA，该亚型缺乏由23个氨基酸组成的胞质分泌信号序列，不能分泌到胞质中。TEM-1型 β-lactamase在真核生物中没有同源体，对细胞没有毒性，故而β-lactamase-PCA被普遍用于在真核细胞和没有本底表达的大部分真核生物个体中的蛋白相互作用研究。

β-lactamase-PCA检测方法包括：第一，以头孢菌素类的衍生物头孢硝噻吩（nitrocefin）为底物，用细胞裂解液进行比色测定，当底物发生水解时，颜色会由黄色变成红色。由于nitrocefin不能透过细胞膜，故只能检测细胞裂解液中的蛋白相互作用；第二，用完整的细胞进行荧光分析，以CCF2/AM为荧光底物，当CCF2/AM进入细胞膜，在胞内酯酶的作用下释放内酰胺酶的底物CCF2。CCF2能够被双重激发，在409 nm波长激发光下将能量传递给受体发色基团，在520 nm波长处发绿色荧光。而当CCF2在β-内酰胺酶作用下水解则使2个发色基团分开。在相同激发光下，因发色基团离受体较远（>10 nm），供受体之间不能发生荧光能量共振，只能于477 nm波长处发出供体自身的蓝色荧光。检测细胞内荧光定量，或运用荧光显微镜通过观察细胞内因底物降解而发生蓝色荧光及其定位来判断β-内酰胺酶的两个片段是否因目标蛋白相互作用而互补，恢复了完整的β-内酰胺酶活性。

2.3 基于荧光蛋白的PCA

绿色荧光蛋白及其变种由于不需要任何底物或者辅助因子就可以产生荧光，被广泛用作PCA的报告蛋白，通过荧光显微镜、流式细胞术、光谱法等可用GFP-PCA，YFP-PCA观察蛋白之间的相互作用，活细胞内蛋白复合体的形成，还可应用到细胞cDNA文库的筛选等［10］。但是与具有酶活性的报告蛋白相比，基于荧光蛋白的PCA不适合进行定量化和动态研究，仅能作为定性研究。

2.4 基于荧光素酶的PCA

分泌型荧光素酶（Gaussia luciferase，Gluc）和花虫型荧光素酶（Renilla luciferases，Rluc）均是从海洋发光生物体中分离出来的荧光素酶。Gluc是由185个、Rluc是由312个氨基酸残基组成的蛋白质分子，在有氧环境中，作用于底物腔肠素，在480 nm波长激发光下发蓝色荧光。Gluc是一种分泌性蛋白酶，可以检测培养细胞上清，或实验动物体液，对酶活性进行定量分析。

Michnick［11］于人源化Gluc第93位氨基酸进行剪切形成2个片段，通过连接子连接目标蛋白，分析了TGF-β信号通路中一些分子之间的相互作用，以及药物处理对相关信号分子间相互作用的影响。Stefan等［7］成功地运用Rluc-PCA技术研究了蛋白激酶A在G蛋白偶联受体介导的信号通路中的作用及药物处理对信号转导影响的定量分析。Gehl等［12］利用浮叶荧光素酶为报告蛋白的PCA方法实时定量分析了钼元素辅因子生物合成蛋白CNX6和CNX7，实现了实时定量监测蛋白复合体的组装。

2.5 基于Cre重组酶的PCA

Cre重组酶存在于大肠杆菌噬菌体P1中，由343个氨基酸组成DNA重组酶，可识别Loxp位点等特异性序列而引起DNA重组。研究表明，切割后的Cre重组酶片段允许其两个启动子调控DNA重组。

Hirrlinger等［8］设 计 了Cre-ERT2-PCA方 法，ERT2是人雌二醇受体，Cre-ERT2是将Cre融合到ERT2配体结构域。Cre-ERT2对他莫昔芬及其代谢产物4-羟泰米芬（4-OHT）有高度敏感性，在缺乏诱导剂他莫昔芬时，融合蛋白将被热激蛋白绑定，在细胞浆中无法进入胞核。而加入他莫昔芬时，Cre-ERT2将从复合体中释放出来，进入细胞核切除LoxP位点之间的序列。研究结果表明，该方法适用于包含Loxp等位基因的模型小鼠诱导DNA重组。

3 PCA的应用

3.1 筛选相互作用的蛋白质文库

Galarneau等［10］证实β-lactamase-PCA提供了一种筛选蛋白相互作用的模型，该模型对于信号和本底表达的比例可达到10∶1到250∶1，较其他的PCA效果灵敏。该方法具有一定的广泛性，作者检测了一些已知的蛋白相互作用，包括同型二聚体的亮氨酸拉链模型，Bad和Bcl2，PKB以及底物Bad。研究表明，β-lactamase PCA允许检测蛋白之间相互作用，因为没有近似的本底表达导致酶的自发折叠。

具有简单性、灵敏性和稳固性的体外β-lactamase PCA提供了一种大规模分析蛋白相互作用的有用的方法。而荧光共振能量转移策略可以提供相同的信息，但是在大规模应用中需要小心地检测荧光染料标记的蛋白表达水平；β-半乳糖苷酶亚基互补策略分析有自发亚基组合导致有本底表达的干扰。

3.2 cDNA文库筛选

PCA方法是一种高通量的蛋白质文库筛选方法，该方法依赖于细胞依赖性蛋白的特殊功能的筛选。首先是猎物蛋白和诱饵蛋白自然发生的相互作用，通过在活细胞内监测PCA报告蛋白的再折叠。筛选的重要的特点是相互作用可以直接被检测到，同时PCA片段不会干扰蛋白的靶向作用和修饰作用。继而通过PCA检测到的蛋白相互作用能被代理剂扰乱，如激素类或特殊的抑制剂［10］。

GFP-PCA可以检测蛋白相互作用的亚细胞定位，信号通路中的代理剂的影响。因此，依赖于PCA的筛选策略都会和一些直接的功能分析相结合。研究者应用这一策略来鉴定丝/苏氨酸蛋白激酶PKB/Akt的新型的底物和调节物。该方法提供了鉴定和确证任何细胞过程中蛋白的作用，识别酶的底物和调节蛋白［11］。

3.3 绘制生物化学网络

生物化学的网络图可以通过研究活细胞内的蛋白和蛋白之间动态的研究来绘制。通过PCA这种方法可以绘制动态图以及鉴定在这个网络中可能出现的新的起某种作用的元件。该方法比传统的靶向药物治疗提高了准确度。

Michnick等［13］利用DHFR-PCA绘制了酪氨酸激酶受体介导的信号转导途径发现，RTK信号通路网络与现有模型一致，同时还发现一些新型的相互作用（35个全长蛋白中有14个有效，其中有5个是新发现的）。结果表明PCA策略可以完成一般基因功能的确认及通路图的绘制，同时可以监测信号通路中蛋白质的一些潜在的反应。该方法的一个大规模的应用是连接一个特殊的药物在特异性的信号通路途径中，监测药物的作用。Remy等［14］设计的GFP-PCA的方法可以探测完整的活细胞内蛋白的相互作用，不仅可以动态研究蛋白的相互作用，而且可以研究在物理或者化学因子作用下的微干扰，并设计了Gluc-PCA监测TGF-β信号通路中Smad和PKB的表达情况。Michnick［15］使用YFP-PCA方法研究MAP激酶介导的信号通路，绘制该通路中影响因子，继而筛选一些药物和治疗靶点。Manderson等［16］用依赖于荧光素酶的PCA发现一种新的丝/苏氨酸激酶ElmI在酵母转录因子SBF的失活中起很重要的作用。Stefan［7］使用Rluc-PCA定量研究了G蛋白偶联受体通路中的一些药物处理后的影响，绘制相关作用网络，应用于药物筛选。

3.4 配受体相互作用及潜在治疗

配受体相互作用促进胞内信号转导，治疗因素靶向细胞表面受体继而与配体结合。着重强调研究配受体复合体在完整的细胞内和活体动物中完成对正常的信号通路中疾病，药物作用等方面的研究。目前主要用的是荧光或放射性配体。发展成像分析在生理条件下定量检测配受体复合体促进了对疾病和加快药物递送的研究进展。

Luker等［17］使用荧光素酶蛋白片段互补分析定量的检测趋化因子配体12（CXCL12）和趋化因子受体4，7（CXCR4，7）绑定情况。研究表明：小分子抑制剂CXCR4和CXCR7可以特异性的阻滞CXCL12在细胞内的结合，同时显示不同的趋化因子抑制剂在与受体结合时动力学的不同。在小鼠乳腺癌模型生物发光成像技术展示了CXCL12-CXCR7结合发生在转移性肿瘤中。Gluc-PCA可以定量的分析药物的靶向作用，允许实时定量的分析受体的靶向性，其生成物在肿瘤生长和转移时效应。且该成像系统可以应用于任何配受体结合的分析。

3.5 发现新型药物及高通量筛选药物

G蛋白偶联受体超家族是很重要的一类制药靶点，用以研发新型药物，而激动剂诱导的第二信使以及下游的蛋白激酶A（PKA）是信号通路中的关键影响因子。

Stefan等［6］设计了Rluc-PCA研究发现相关信号通路中的特异性药物。该方法可以实时定量的研究某一特异的激动剂及拮抗剂对于细胞或小鼠的影响。Löfdahl等［18］用β-lactamase筛 选 与TNF-α结合的亲合体分子，用于高通量筛选药物治疗肿瘤。Hashimoto等［19］以单体的香菇珊瑚来源的绿色荧光蛋白（mKG）为报告基因，在试管内使用PCA方法高通量筛选蛋白相互作用抑制剂，完成了高通量筛选药物。研究表明，在TCF7/β-catenin，PAC1/PAC2，PAC3同源二聚体之间的相互作用的抑制剂中，氨硫脲（TB1）只是PAC3同源二聚体的抑制剂。

4 小结

PCA技术是近几年研究蛋白相互作用的重要策略之一，具有高灵敏性，可逆性，高通量筛选等一系列的优势，同时报告蛋白提供了明确可行的检测手段，包括荧光显微镜，酶和底物显色反应。PCA可实时定量动态的反映出蛋白复合体的组装与解离过程，应用于体内外的试验，且克服了双分子荧光互补技术中荧光片段的自发互补及其不可逆性。而荧光共振能量转移技术及生物发光能量共振转移对供体的发射光谱和受体激发光谱有一定的要求，因此需要更精密的仪器，且操作复杂［20，21］。

PCA技术在高通量药物筛选方面的应用是目前关注的焦点，提高了药物治疗的靶向性，为研发新药奠定了基础。但是PCA互补片段如何重新组合并部分恢复其功能的结构基础还不是很清楚，这其中涉及到蛋白的折叠和两个肽段之间精细的相互作用。如果在以后的研究中克服因信号放大产生的假阳性结果，以及外源蛋白过量表达对细胞产生毒害，PCA将会在生命科学及医药研究领域中得到更广泛的应用。

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