破伤风杆菌发酵液澄清过滤试验

吴永超 杨国有 唐朝晖 张华 杨金亮 秦敏*

(1.四川大学生物治疗国家重点实验室 四川成都 610041;2.成都生物制品研究所有限责任公司菌苗一室 四川成都 610023)

破伤风(Tetanus)是由破伤风梭状芽孢杆菌的感染引起的严重感染性疾病,在发展中国家仍是一个主要的公共卫生问题,一般估计每年死于破伤风的人数约为100万,其中约80%为新生儿。早在19～20世纪,已证明破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌产生的破伤风毒素引起的,并获得了用毒素脱毒制成类毒素预防破伤风的有效方法。破伤风类毒素制剂主要有破伤风疫苗、白喉破伤风联合疫苗以及百日咳-白喉-破伤风联合疫苗。我国主要采用无细胞百白破联合疫苗(DTaP)对儿童进行计划免疫,100%的被免疫者可达到保护水平以上,且10-15年仍有80%的人群其抗体仍在保护水平之上[1][2]。破伤风类毒素也常作为蛋白载体用于结合疫苗,如b型流感嗜血杆菌-破伤风类毒素(Hib-TT)结合疫苗,14型肺炎球菌荚膜多糖－破伤风类毒素结合疫苗等。

图1 Vmax 恒压试验示意图Fig 1 Schematic diagram of Vmax

图2 Pmax 恒流试验示意图Fig 2 Schematic diagram of Pmax

破伤风类毒素制备采用破伤风杆菌于液体产毒培养基中发酵培养,发酵液澄清过滤去除菌体后超滤浓缩,再经纯化后甲醛脱毒制成类毒素。澄清过滤从最初的帆布过滤,过渡到板框滤器过滤。板框滤器采用EKS滤板过滤,为半开放式,EKS滤板的吸附损失较大,过滤时常常需要更换滤板,对制品和环境都存在较大的安全风险。为符合GMP要求,本文选用表面滤器P olyse p II C GW3(1.0/0.2um)和深层滤器Millistak+X0HC(0.2um)两种密闭式滤器进行破伤风杆菌发酵液澄清过滤对比试验,考察两种滤器的澄清效果和对破伤风毒素的吸附情况,并对实际工艺所需的膜面积进行推算,筛选合适的滤器类型,选择出一种安全经济高效的过滤器。

图3 Polysep II CGW3 Vmax 试验曲线Figure 3 the curves of Polysep II CGW3 Vmax test

图4 Millistak+ X0HC Pmax 曲线Figure 4 the curve of Millistak+ X0HC Pmax

1 材料和方法

1.1 试验样品

1.2 主要试剂及仪器

破伤风抗毒素国家标准品购自中国食品药品检定研究院;表面滤器Polysep II CGW3面积13.8 cm2,深层滤器Millist ak+X0HC面积26cm2,均由Merck millipore公司提供;JY10001电子天平为上海精密科学仪器有限公司产品;Micro 950浊度仪为英国百灵达有限公司产品;BT100-2J恒流泵为保定兰格恒流泵有限公司产品。

1.3 Vmax试验

Vmax试验即恒压试验,即在恒定压力下使料液通过过滤器,并在一定时间间隔记录滤液体积, 其基本原理是依据滤膜逐渐堵塞模型方程,通过计算可预知滤器的最大负载和流量衰减,从而进行过滤器的选型放大[4],适用于Polysep II CGW3(1.0/0.2um)表面滤器。

按(图1)所示安装系统,准备约2 L料液,设定过滤压力恒为10psi,当第一滴料液进入收集容器时开始秒表计时,持续约10分钟,在适当时间间隔测定滤液体积(测定重量转换)及毒素絮状单位,并对滤液的浊度进行检测。根据记录的数据计算出Polysep II CGW3(1.0/0.2um)表面滤器的通量,载量,T/V等。

1.4 Pmax 试验

Pmax试验即恒定流速试验,以恒定的流速使料液通过滤器,记录一定时间间隔的过滤器压降和滤液体积,当滤器的压降达到设定值(基本完全堵塞的压力值)时停止试验。对于以吸附为主要截留方式的过滤,以浊度的贯穿(吸附位点基本饱和)作为试验终止的依据。深层过滤不符合逐渐堵塞模型,不适用于Vmax试验,故Millistak+X0HC深层滤器采用Pmax试验。

按(图2)所示安装系统,设定恒定流速为12ml/min(通量为281.4LMH),记录一定时间间隔的过滤器压降和滤液体积及毒素絮状单位,试验过程中同时测量滤液浊度,当浊度贯穿(比初始值高40～50%)或者达到压力上限时(15～20psi),试验终止。

2 结果

2.1 Vmax 试验结果

从(表1)中可看出,随着时间增加,滤器的载量逐渐升高,通量逐渐降低,但在各时间段料液的毒素絮状单位与滤前相比没有变化,均为120lf/ml,说明Polysep II CGW3滤器对破伤风毒素的吸附很小,损失可以忽略不计。滤前料液浊度为14.2NTU,过滤后为4.72NTU,说明澄清过滤效果较好。

以t(min)为横坐标,t/V(min/ml)为纵坐标作出Vmax试验曲线图如图3,其R2值=0.9991>0.99,说明Vmax逐渐堵塞模型的有效性。

表1 Vmax 试验数据Table 1 Vmax test date

表2 Pmax 试验数据Table 2 Pmax test data

具有工艺时间限制的滤膜面积计算公式为:Area=Vb/Vmax+Vb/(QiTb)[3],其中Vb为工艺体积,Vmax为最大过滤体积,Qi为起始流量,Tb为工艺时间。

根据图3,Vmax=1/0.0015=666.7ml,滤膜面积为13.8cm2,单位面积Vmax(即最大载量)=0.6667ml/0.00138m2=483.1L/m2。同理,Qi=1/0.0038=263.2ml/min=15.79L/h,单位面积的Qi=11442.0L/m2h。

与一般项目不同，科研项目通常具有研究周期长、技术难度大、投资规模大、不可预见性大等特征。因此，科研项目管理的难度也较大。企业作为科研项目实施主体之一，应该加强项目全过程管理、重视科研项目的转化和推广、加强科研项目经费管理，提高科研项目管理的有效性。

若需2 h 内完成6 00 L料液的过滤,所需的该种膜面积=V b/Vmax+Vb/(Qi×Tb)=1.27m2。若过滤时间为1h,则所需最低膜面积=1.29m2。

2.2 Pmax 试验结果

由（表2）可知,在过滤速度基本恒定的情况下,随着过滤时间延长,过滤压力逐渐增大,滤液浊度逐渐升高,滤器的载量升高,但各时间段料液的毒素絮状单位与滤前相比没有变化,均为120lf/ml,说明Millistak+XOHC滤器对破伤风毒素的吸附可忽略不计。滤前料液浊度为14.2NTU,过滤后为2.06NTU,澄清过滤效果好。

以载量为横坐标,压阻(psid/LMH)为纵坐标作出Pmax曲线图[4][5],如图4:

由表2及图4,Millistak+XOHC滤器过滤约1.2L后,滤器压降上升至10psi,若要求600L料液过滤时间为1h,根据图4中公式可计算出滤器最大载量为349L/m2,则使用最低滤膜面积为1.72m2。若延长过滤时间为2h,则滤器载量可提高至511L/m2,最低滤膜面积为1.18m2。

2.3 比较

由(表3)可看出,Millistak+X0HC滤器和Polysep II CGW3滤器对破伤风毒素的吸附都很小,Millistak+ X0HC滤器的澄清过滤效果要优于Polysep II CGW3滤器。

若要求1～2小时内完成600L料液的过滤,根据计算结果得出(表4),Millistak+X0HC滤器的最大载量受过滤时间的影响较大,过滤时间越短,要求滤器的膜面积越大;而Polysep II CGW3滤器的最大载量受过滤时间的影响很小。

2.4 放大应用

根据两种滤器的小量试验结果,两种滤器对破伤风毒素的吸附均很小,Millistak+X0HC滤器的澄清过滤效果要略优于Polysep II CGW3滤器,但Millistak+X0HC滤器的载量受过滤时间的影响,对过滤条件的要求较高。Polysep II CGW3滤器的最大载量比较稳定,且在实际生产中,须在最低需求面积基础上设定一个1.2～1.5倍左右的安全系数,滤液浊度还可以下降。故选择Polysep II CGW3滤器进行了放大试验,与板框滤器过滤进行比较,结果如表5:

表3 两种滤器过滤结果比较Table 3 Comparison of the results of two kinds of filters

表4 两种滤器需求面积比较Table 4 Comparison of the area of two kinds of filters

表5 放大试验结果Table 5 the results of scale-up test

3 讨论

通过小量试验中两种滤器在毒素吸附、滤液澄清度及膜面积等方面的比较,初步筛选出Polysep II CGW3滤器进行放大应用,进一步验证了其小量试验结果。

通过表5,可得出Polysep II CGW3滤器与板框滤器的比较:(1)Polysep II CGW3滤器过滤后滤液浊度虽略高,但对后续的超滤浓缩无明显影响;(2)Polysep II CGW3滤器过滤损失很小,只有板框滤器过滤损失的1/20;(3)Polysep II CGW3滤器缩短了整体工艺时间;(4)从经济上考虑,板框滤器使用的滤板为一次性使用,成本较高;(5)Polysep II CGW3滤器为密闭式,大大提高了对制品和环境的安全性,符合GMP要求。因此,综合考虑安全、经济、效率等方面因素,Polysep II CGW3滤器可替代板框滤器用于实际生产。

生物制药业是目前发展最活跃、进展最快的产业之一,21世纪是生物制药行业飞速发展的时代,但中国的生物制药业发展水平仍比较落后,其中支撑技术和设备的落后是一个主要原因。因此,亟需加强生物制药行业的相关技术及装备的产业化、国际化,不断促进技术装备更新换代,中国生物制药业才能得到更快更好的发展。

[1]赵凯,章以浩,李河民.医学生物制品学[M].(第2 版).北京:人民卫生出版社,2007.10:697-702.

[2]张延龄,张晖.疫苗学[M].(第1 版).北京:科学出版社,2006.03:855-875.

[3]寿建斐.过滤器选择系列-恒压载量测试实验Vmax[J/OL].BIOPROCESS NOW,2009.12(四):4-7. http://wenku.baidu.com/view/0b417c1614791711cc791756.html(2011/7/31).

[4]唐正姣,欧阳贻德,陈中.恒压过滤实验数据处理的探讨[J].化学工程师,2004.06:21-22.

[5]丁启圣,王维一.新型实用过滤技术[M].(第3 版).北京:冶金工业出版社,2011.06.