蛇毒神经生长因子干预HSC-T6细胞差异蛋白质分析

徐瑾 张学荣 胡仁统 罗小玲 陈缨 林兴 廖明 付娆 付道滢

（1.广西医科大学医学科学实验中心，南宁 530021；2.广西医科大学肿瘤医院，南宁 530021）

肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理途径，其发生发展过程中涉及到多种细胞、细胞因子及其信号转导通路之间一系列复杂的变化，主要病理改变是细胞外基质的过度合成与异常沉积。肝星状细胞（HSC）是参与该过程的最重要细胞，HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的中心环节，抑制HSC增殖、诱导其凋亡是抗肝纤维化的重要策略［1］。近年来，神经生长因子（NGF）诱导HSC凋亡现象的发现［2］使其有望从神经系统疾病领域应用到肝纤维化的治疗中。蛋白质组学（Proteomics）作为后基因时代研究的一个重要内容，其理论和技术的发展完善亦为肝纤维化的研究带来了新的思维方式和研究领域。将这种高通量的研究策略引用到肝纤维化发生过程中，能够在一个试验系统中同时研究多种蛋白质的变化，有助于全面阐明肝纤维化发生发展过程中各种蛋白质的变化情况［3］。本课题组前期研究发现，NGF对HSC-T6 增殖具有抑制作用，并能够促进其凋亡［4］。在此基础上，本试验运用双向凝胶电泳（2-DE）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等技术对眼镜蛇毒神经生长因子（NGF）干预大鼠肝星状细胞（HSC-T6）前后蛋白质表达的差异，并分析部分差异蛋白的类型、功能以及在信号传导通路的作用，进一步在蛋白水平上揭示人类肝纤维化发生发展过程及NGF抗肝纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

眼镜蛇蛇毒NGF由广西医科大学蛇毒研究所提供；大鼠HSC-T6购于湖南湘雅医学院；DMEM高糖培养基购自HYCLONE公司，胎牛血清购自GIBCO公司；HSC-T6细胞用含体积分数为10%胎牛血清+1%双抗的DMED培养液，置CO2培养箱（37℃、5% CO2）培养。双向电泳和质谱所用试剂购自Promega公司，CHAPS、碘乙酰胺、硫脲、17 cm固相pH梯度（IPG）干胶条（pH3-10）、固相pH梯度胶条缓冲液（IPG buffer pH3-10）、两性电解质（Pharmalyte，pH3-10）、硝酸银、Nuclease Mix、IPGphorTM等电聚焦系统、Ettan DALT Six 垂直电泳仪、高分辨的图像扫描仪和凝胶斑点采集仪（Picker）购 于Bio-Rad公 司。点 样 仪（Digester）、MALDITOF-TOF及图像分析软件Image Master2-DE Elite为Amersham Pharmacia公司产品。所有试剂用去离子水配置。

1.2 方法

1.2.1 HSC-T6细胞总蛋白的提取 取生长良好的HSC-T6细胞于25 mL培养瓶里进行培养，等到细胞长满培养瓶的70%左右开始药物作用，试验设计4个组，空白对照组（只用培养基培养），而处理组分3组，用NGF作用，低、中、高浓度分别为4、8和16 mg/L。用10%胎牛血清的DMED培养基培养，药物作用24 h后分别提取细胞总蛋白，同时每个组做3次平行试验。把提取的细胞总蛋白用3 kD超滤管进行超滤脱盐，然后用考马斯亮蓝法定量蛋白质浓度，最后把蛋白质等量分装真空冻干机冻干备用。

1.2.2 双向凝胶电泳 使用17 cm IPG胶条（非线性）进行等电聚焦电泳，应用胶内泡胀法进行加样，蛋白上样量为500 μg。采用低电压50 V，12 h主动水化。等电聚焦步骤为：500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 5 h，待17 cm胶条等电聚焦总电压伏时达到60 000 V时结束聚焦。将胶条取出，在平衡液中进行平衡：第一步使用含有1% DTT的平衡液，15 min；第二步用含4%碘乙酰胺的平衡液，15 min。平衡后将胶条转移到12%的SDS-PAGE上，用0.5%低熔点琼脂糖封胶后进行第二向电泳，电泳条件为每块胶恒定电流10 mA，30 min后将电流加大到30 mA，待溴酚蓝指示带到达凝胶底部处结束电泳。

1.2.3 银染 SDS-PAGE凝胶使用固定液固定30 min或者过夜，敏化液敏化30 min，用蒸馏水漂洗3次，每次15 min，然后银染20 min，倒掉银染液用蒸馏水漂洗2次，每次1 min，马上加入显色液晃动直到看到明显的蛋白点，立刻用终止液进行终止反应，并用蒸馏水保存。最后通过GS-800凝胶扫描仪获得数字化图像，然后用PD Quest7.3软件进行分析。

1.2.4 差异蛋白点分析和质谱鉴定 将对照组和试验组中1.8倍差异表达的蛋白质点从凝胶上切下来，然后进行胶内酶解，酶解过夜进行萃取，并对萃取液进用Zip Tip脱盐柱除盐，把所得多肽与基质1∶1混合，吸取2 μL混合液点在靶上，让靶点自然干燥后装入质谱仪，MALDI-TOF/TOF-MS检测，鉴定出差异蛋白。此步骤由广西医科大学医学科学实验中心蛋白组学协助完成。

1.2.5 生物信息学分析 将双向电泳和MALDITOF/TOF-MS筛选出来的的差异蛋白质汇总，应用UNIPROT数据库网站和DAVID数据分析软件，按照其生物学功能及在机体内参与的生理学反应过程将所有的差异蛋白进行GO（Gene Ontology）分类（http：//www.geneontology.org/）。对差异蛋白质生物学过程（Biological Process，BP）、亚细胞定位（Cellular Component，CC）、分 子 功 能（Molecular Function，MF）和信号传导通路（Pathway）等分析。再结合聚类分析等找到我们所研究生物系统相对对照组在亚细胞定位、生物通路、分子功能和相互作用网络中的变化趋势，找到与肝纤维化相关的生物学过程等。

1.2.6 统计学处理 数据统计分析由STATA 7.0 统计分析软件（State Corp，College Station，TX，USA）完成。

2 结果

2.1 细胞总蛋白SDS-PAGE电泳图

空白对照组及NGF干预各组在相同条件下作用24 h后分别提取组细胞总蛋白，并对细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳，用扫描仪进行扫描分析，从图1中可发现细胞总蛋白的条带清晰，分子量大小不一，NGF干预个组与空白对照组并无明显的差异。

图1 细胞蛋白SDS-PAGE电泳图

2.2 双向电泳

对4组细胞总蛋白进行双向电泳，利用图像分析软件对蛋白图谱进行分析比较。首先以对照组建立一个参考胶进行自动性的粗略匹配，每一个个体胶蛋白点与参考胶进行手工匹配和比对。在对照组细胞蛋白双向电泳图谱上可观察到668个蛋白点，而试验组中的低浓度组可见到647个蛋白点、中浓度640个点、高浓度645个点。以对照组为标准，3个试验组图谱分别与对照组的匹配率依次为96.8%、95.8%和96.5%，其中在低浓度组中箭头标注并有蛋白质ID号的蛋白质点为NGF干预之后质谱鉴定结果差异表达的蛋白质，只有箭头标注的为双向电泳图谱有差异而在质谱鉴定并没有确定的蛋白质点（图2）。

图2 双向电泳图

2.3 差异蛋白质点的质谱分析

在4组试验中，试验组和对照组细胞中表达量相差1.8倍以上的蛋白点共16个，通过胶内原位酶解进行PMF的测定，经一级质谱和二级质谱获得的13张PMF图谱，利用PEPTIDEM查询软件搜索MASCOT数据库得到13个蛋白质，在NGF作用后的肝星状细胞中表达上调的蛋白6个（表1），表达下调的蛋白7个（表2），结合双向电泳图发现部分蛋质点的差异表达随着NGF浓度的增加而呈递增性，部分随着NGF浓度的增加呈递减性，这些差异蛋白质按其功能可分为细胞信号转导、细胞增殖、细胞凋亡、氧化应激相关以及功能尚不清楚的蛋白质。

表1 NGF作用肝星状细胞（HSC-T6）后表达上调的蛋白

表2 NGF作用肝星状细胞（HSC-T6）后表达下调的蛋白

2.4 双向电泳与质谱鉴定出来的差异蛋白质生物信息学分类分析

2.4.1 GO分类 图7显示了质谱鉴定出来的蛋白质的各种GO分类，包括细胞功能定位（Cellular Component，CC）、分子功能定位（Molecular Function，MF）、生物学过程（Biological Process，BP）和信号通路（Pathway）。结果发现，这些差异蛋白的主要定位以细胞器为主（图3-A），分解代谢和酶类蛋白相对较多（图3-B），大部分蛋白参与生物发育、细胞代谢和生物调节等过程（图3-C）；在信号通路上，部分蛋白主要参与肥厚型心肌病（HCM）通路、TGF-β信号转导通路和扩张型心肌病通路（图3-D），其中TGF-β信号转导通路是肝纤维化发生发展过程中一个重要的信号传导通路。

图3 差异蛋白质的GO分类和信号传导通路分类

2.4.2 TGF-β信号传导通路分析 在所鉴定的差异蛋白质中一部分是功能已知，有文献报道与肝纤维化发生发展有明确关系的蛋白质。同时也有许多功能未知的差异表达蛋白，这部分蛋白质是否与肝纤维化发展相关是值得探究的问题，同时也是我们关注的重点和进行后续验证和判断诊断价值的意义所在。TGF-β信号传导通路是肝纤维化发生发展研究最多的一条信号传导通路，通过TGF-β信号传导通路分析发现，转化生长因子TGF-β（transforming growth factor）和转化蛋白RHOA（Transforming protein RHOA）在整个信号传导通路中具有串联其他蛋白相互联系的作用，这两个蛋白的表达变化可能参与肝纤维化的发生发展过程（图4）。

图4 TGF-β信号传导通路图

3 讨论

神经生长因子（NGF）对神经系统疾病的治疗作用已被公认，但在肝纤维化领域的研究还知之甚少。近年来，NGF诱导HSC凋亡为抗肝纤维化药物的研发提供了一个新的靶点［2］，HSC是肝纤维化形成过程中合成细胞外基质的最重要细胞，抑制HSC增殖、诱导其凋亡是抗肝纤维化的关键。研究表明，调节细胞因子活性是可行的和具有特异性的肝纤维化治疗方法［5］，NGF作为近年来发现的HSC凋亡诱导剂［6］，已在肝纤维化的研究中引起重视。Trim等［2］将100 mg/L NGF与HSC共同培养24 h后，发现HSC凋亡数量显著增加，呈剂量依赖关系，指出NGF对体外培养活化的HSC凋亡有诱导作用，其作用机制可能包括NGF及其低亲和力受体p75的作用。本课题组前期研究将最适浓度的蛇毒神经生长因子NGF（8 mg/L）与HSC-T6共同培养24 h，用MTT法检测发现，NGF抑制HSC-T6增殖呈时间依赖性。并且随着NGF浓度的增加呈剂量依赖性，流式细胞术显示具有诱导其凋亡的作用［4］，这和Trim的结论相符合。

肝纤维化中没有基因的异常，而是某些基因过度表达或表达不足，对激活并过度表达的胶原基因进行抑制或封闭，具有广阔的治疗前景［7］。NGF诱导HSC凋亡现象的发现为抗肝纤维化药物的研发提供了一个新的靶点。蛋白质组学作为后基因组时代研究的一个重要内容，蛋白质是细胞、组织乃至生物体发挥其功能的基本物质，因此，在蛋白组水平上研究肝纤维化发生发展过程中蛋白质的变化对揭示肝纤维化的发病机制以及预防和治疗肝纤维化具有极其重要的现实意义。随着双向电泳和质谱技术的发展，为在蛋白组学水平上研究蛋白质的表达提供了科学而实用的工具以及思维方式。

本试验用不同浓度的NGF干预HSC-T6细胞，通过双向电泳技术和时间飞行质谱技术发现一些蛋白质在NGF作用24 h后表达上有了较明显的变化，通过生物信息学分析发现这些差异蛋白主要参与细胞信号传导、细胞增殖、细胞代谢和氧化应激等过程。其中转化生长因子TGF-β和转化蛋白 RHOA还参与了TGF-β信号传导通路，并且在TGF-β信号传导通路中起着关键性的作用。信号传导是指细胞因子通过膜上受体引起细胞内的级联反应而发挥细胞的生理功能的过程，在这个过程中，不同信号传导通路通过各种串话互相影响、制约，共同调控各种细胞行为和生理变化过程［8］。肝纤维化发生发展是一个多细胞，多因素的复杂过程，近年来越来越多的证据表明，信号传导通路在肝纤维化发展过程起着极其重要的作用，并且信号转导通常并不是单独进行的，而是存在于一个极为复杂的信号通路网络中，彼此之间相互影响、相互调控［9］。而在肝纤维化过程中NGF信号和TGF-β1信号越来越受到重视，NGF是最早发现的神经营养因子家族成员，它具有维持交感神经和感觉神经的生存、影响中枢神经元的生长、促进神经细胞的分化、决定轴突生长等方面的生物学功能［10，11］。TGF-β1超家族成员众多，功能广泛，参与调控各种细胞生长与增殖、分化与凋亡以及胞外基质重塑与迁移等，其中大部分作用都是由SMAD蛋白介导的经典信号通路参与实现的［12，13］。研究表明，NGF信号与TGF-β信号之间具有多种串话机制，例如，在牙髓细胞（dental pulp cells）中，TGF-β可以通过MAPK信号通路来上调NGF的表达［14］；而NGF促进小神经胶质迁移的过程受到TGF-β的调控［15］。肝纤维化的中心环节是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活［16］。活化的HSC可分泌基质金属蛋白酶（matrix metatloproteinase，MMP）和金属蛋白酶组织抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP），但是两者的分泌量失衡，从而造成I、Ⅲ型胶原为主的ECM成分大量合成和降解不足，进而在肝脏中大量沉积，成为肝纤维化发生、发展的重要环节。转化生长因子（TGF-β）是重要的促进肝纤维化的细胞因子，主要通过SMAD蛋白信号通路，促进肝星状细胞增殖和活化，其中SMAD3是TGF-β/SMAD信号通路中的关键信号蛋白［17，18］。众多研究表明，阻断TGF-β1通路可有力地阻断肝纤维化［19，20］。但由于TGF-β1 的多功能性，完全阻断则可能造成严重的副作用［21］，为减小其可能附带的不良反应这一目标，选择恰当的治疗靶标成了必须解决的问题。

本试验用眼镜蛇毒NGF作用HSC-T6细胞，发现TGF-β1表达下调，这可能是NGF信号传导通路与TGF-β1信号传导通路通过串话机制发挥作用，导致TGF-β1信号传导通路通受到抑制。同时也发现金属蛋白酶组织抑制物（TIMP-2）也随之表达下调，TIMP-2是抑制ECM合成的一个重要酶类，其表达下调导致ECM的合成减少而分解加快，从而使肝纤维化的发展得到缓解甚至逆转。在鉴定出的其他差异蛋白质中多数为酶类，而酶主要参与细胞的代谢、氧化分解过程，目前虽然没有太多的研究表明这些酶直接参与肝纤维化。但是从肝纤维化的发生发展过程提示我们，这些酶可能影响细胞的正常代谢，使细胞的生长不能有效的维持从而导致细胞发生凋亡甚至死亡，这也使得活化的肝纤维化细胞减少，而减少活化的肝纤维化细胞恰好是逆转肝纤维化的重要途径，在这些因素的共同作用下达到抗肝纤维化的目的。

以上试验显示，眼镜蛇毒NGF可影响HSC-T6细胞蛋白的差异表达，提示NGF可能是通过参与HSC细胞信号传导通路并改变肝纤维化相关蛋白质的差异表达来实现抗肝纤维化的目的。由于双向电泳本身的局限性，使一些等电点和分子量相近的蛋白不能有效的判定其差异表达，在影响信号传导通路过程中应该找出更多与信号通路相关的蛋白表达情况，并进行后续的验证，从而更加深入揭示肝纤维化发生发展机制及为NGF抗肝纤维化预防和治疗提供理论依据。

4 结论

眼镜蛇毒NGF能改变HSC-T6细胞信号通路中相关蛋白质的差异表达，其作用的机理可能是通过上调或者下调这些差异蛋白质来实现抑制HSC-T6细胞增殖、诱导HSC-T6细胞凋亡从而逆转肝纤维化的发生发展，为在蛋白质水平研究NGF抗肝纤维化机制提供理论依据。

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