不同产地怀牛膝β－蜕皮甾酮含量测定及指纹图谱研究

张留记 ，孙丹丹，屠万倩，刘钦松

1河南中医学院，郑州450008;2河南省中医药研究院，郑州450004

牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，是中国药典2010 年版一部收载品种，具有补肝肾、强筋骨、通血脉、降血压及镇痛等功效［1］，用于经闭、痛经、腰膝酸痛、筋骨无力、淋症、水肿、头痛、眩晕、牙痛、口疮、吐血、衄血等症的治疗［2］。牛膝主产于河南焦作(古怀庆府)，是河南“四大怀药”之一，种植历史悠久、质量优良、产量较大，被认为《本经》所载上品牛膝［3］。作为大宗常用中药品种，牛膝的市场需求量较大，在我国河北、山东、内蒙、安徽等不同地区也有规模化种植。牛膝中含有甾体、甾酮、皂苷、异黄酮和多糖等多种成分［4-6］，其中β-蜕皮甾酮(β-ecdysterone，EDS)为含量较高的三萜甾酮类成分。研究表明，牛膝中的三萜及蜕皮甾酮有抑制破骨细胞分化、促成骨样细胞增殖活性，促进蛋白质的合成作用;抑制由于药物引起的血糖升高，降胆固醇作用;使受损的细胞再生，与牛膝“补肝肾、强筋骨”功效相吻合［7，8］。中国药典2010 年版一部中牛膝药材的质量标准中采用HPLC 法建立了β-蜕皮甾酮的含量测定方法［9］。考虑到怀牛膝药材中化学成分较复杂，单一化学成分的含量测定不能全面反映药材的内在质量，指纹图谱技术能较好的表征中药的整体特征性，兼具一定的模糊性，已有对武陟等河南出产的牛膝进行了指纹图谱的研究报道［10，11］，但实验样品仅局限于河南主产的部分怀牛膝样品，对国内其他产地的牛膝未进行测定和比较。本文对不同产地的牛膝药材中β-蜕皮甾酮进行了含量测定，根据HPLC 色谱建立了怀牛膝的指纹图谱，在同一色谱条件下完成牛膝的定性定量，为今后怀牛膝的质量评价和道地性研究提供参考。

1 材料

美国Waters 高效液相色谱仪(2695 溶剂管理系统，2996 二极管阵列检测器，美国Waters 柱温箱，Empower II 工作站);Waters SunFire C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);AE240 十万分之一分析天平(瑞士METTLER 公司);LIBROR-160DPT 万分之一分析天平(日本岛津);甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck 试剂公司)，其余试剂为分析纯，蒸馏水购自郑州市大成蒸馏水厂，重蒸馏水自制。对照品β-蜕皮甾酮(购自中国药品生物制品检定所，批号:111638-200301，为含量测定用对照品)。怀牛膝对照药材购自中国药品生物制品检定所(批号:1006-2002203);供试药材来源见1，经河南省中医药研究院都恒青研究员鉴定均为苋科植物牛膝A.bidentata Bl.的干燥根，凭证标本存放于河南省中医药研究院中药室。

表1 不同产地的牛膝药材来源Table 1 Samples of A.bidentata Bl.from different areas

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters SunFire C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相A:甲醇，流动相B:水，柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长250 nm;记录时间90 min;进样量10 μL。

表2 梯度洗脱时间程序Table 2 Gradient elution profile of mobile phases

2.2 供试品溶液的制备

取怀牛膝粉末(过四号筛)约1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减轻的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL 溶解后，用水饱和的正丁醇提取5 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用水15 mL 洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取β-蜕皮甾酮对照品1.30 mg 置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含β-蜕皮甾酮0.13 mg 的溶液，以0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.4 β-蜕皮甾酮含量测定

2.4.1 线性关系考察

取“2.3 对照品溶液的制备”项下制得的对照品溶液，进样2、5、10、15、20 μL，按“2.1 色谱条件”测定β-蜕皮甾酮色谱峰峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)，进行回归处理，得回归方程:Y=1.59 ×106X-2.26 ×104，r =0.9994。结果表明，β-蜕皮甾酮在0.26 μg～2.60 μg 范围内，进样量与峰面积之间呈良好的线性关系。

2.4.2 加样回收率试验

取已知含量的样品(β-蜕皮甾酮含量为0.634 mg/g)，取约0.5 g，精密称定，置三角烧瓶中，精密加入浓度为0.00584 mg/mL 的β-蜕皮甾酮对照品溶液50 mL，以下按“2.2 供试品溶液的制备”项下方法操作，制备加样回收供试品溶液。精密吸取加样回收供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1色谱条件”测定加样供试品溶液中β-蜕皮甾酮的含量，计算回收率，结果见表3。

表3 β-蜕皮甾酮的加样回收试验结果Table 3 Recoveries of β-ecdysterone

2.4.3 不同产地怀牛膝中β-蜕皮甾酮含量测定

取不同产地怀牛膝样品，按“2.2 供试品溶液的制备”项下方法操作，制备供试品溶液，分别测定其含量，结果见表4。

表4 不同产地怀牛膝药材β-蜕皮甾酮含量测定结果Table 4 Quantification results of β-ecdysterone in samples from different areas

0.5803 0.058 3 0.5354 0.054 4 0.6537 0.065 5 0.5116 0.051 6 0.6114 0.061 7 0.7175 0.072 8 0.6116 0.061 9 0.6349 0.063 10 0.6228 0.062 11 0.6137 0.061 2

12 0.6337 0.063 13 0.6998 0.070 14 0.7708 0.077 15 0.6277 0.062 16 0.6045 0.060 17 0.4652 0.046 18 0.4810 0.048 19 0.5649 0.056 20 0.7240 0.072 21 0.4880 0.049

2.5 HPLC 指纹图谱研究

2.5.1 精密度试验

取5 号样品，按“2.2 供试品溶液的制备”项下方法操作，制备供试品溶液，按“2.1 色谱条件”项下方法，连续6 次进样，记录色谱图，计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD 值，结果各共有峰的RSD 值均小于3%，表明精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

取5 号样品，按“2.2 供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h 进行测定，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD 值，结果RSD 值均小于3%，表明12 h 内供试品溶液基本稳定。

2.5.3 重复性试验

精密称取5 号样品粉末6 份，每份约1 g，按“2.2 供试品溶液的制备”项下方法操作，平行制备6 份供试品溶液。分别进样测定，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD 值，结果RSD 值均小于3%，表明本实验重复性良好。

2.5.4 怀牛膝的HPLC 色谱检测

按“2.2 供试品溶液的制备”项下方法操作，制备供试品溶液，对15 批来自河南道地产区的怀牛膝药材和6 批来自其他不同产地的牛膝药材进行检测，记录色谱图。β-蜕皮甾酮对照品溶液(EDS)及牛膝对照药材(S11)HPLC 色谱图见图1。编号为1～9、12～17 的15 批道地怀牛膝药材供试品的HPLC 色谱叠加图(S1—S9，S12—S17)，见图2。编号为10 的半野生牛膝(S10)、编号为11 的牛膝对照药材(S11)和编号为18～21 的5 批其他产地的牛膝药材供试品的HPLC 色谱叠加图(S18—S21)，见图3。

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 参照峰的选择

将怀牛膝对照品色谱图与样品色谱图中保留时间相对应的色谱峰的紫外吸收光谱进行比较，结果完全一致，供试品色谱图中3 号特征峰确定为β-蜕皮甾酮。各批次样品图谱中β-蜕皮甾酮的色谱峰分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，所以选择β-蜕皮甾酮为参照峰。

2.6.2 不同产地怀牛膝药材指纹图谱及相似度评价

运用药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版软件进行分析，将实验数据导入中药指纹图谱相似度评价软件，设定同一时期采集的同为二等品的12、13、14、15、16 号为参照图谱，将色谱峰自动匹配，生成对照图谱(见图1、图3 中的R)，进行相似度评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出道地怀牛膝药材指纹图谱的共有模式(即对照图谱)，各样品与该共有模式比较，其相似度结果如下:1—11 号分别为0.999、0.998、0.998、0.999、0.998、0. 998、0. 999、0. 958、0. 987、0. 985、0. 982。17—21 号 分 别 为0. 971、0. 949、0. 947、0. 979、0.916。通过建立怀牛膝药材的HPLC 指纹图谱，确定了7 个共有峰，以3 号共有峰牛膝β-蜕皮甾酮为参照峰，计算21 批怀牛膝药材其他共有峰的相对峰面积，结果见表5。

表5 21 批牛膝药材共有峰相对峰面积比值Table 5 Relative peak area of the 7 common peaks of 21 batches of A.bidentata Bl.

3 讨论

3.1 测定方法和仪器的选择

考虑到HPLC 方法成熟，仪器普及率较高，利用该仪器建立怀牛膝中β-蜕皮甾酮含量测定方法和指纹图谱方法，对仪器设备的要求相对较低，所建立方法易重复、易推广，而UPLC、HPLC-MS/MS、HPLC-TOF-MS、UPLC-MS/MS 等先进分析仪器价格昂贵，普及率相对较低，本文所采用的方法具有普遍适用性的特点。

3.2 供试品提取溶剂、提取方法的选择

在实验中，试用了甲醇、水饱和正丁醇、95%乙醇等不同提取溶剂制备供试品溶液。结果表明，以甲醇作为提取溶剂，HPLC 色谱峰较为丰富，提取β-蜕皮甾酮较为完全，故选择甲醇作为提取溶剂。对加热回流、超声处理、索氏提取等不同提取方式进行考察，结果三种方式提取效率相仿，但超声具有提取快速、操作简便的特点，故采用超声为供试品溶液的提取方法。在试验中，还比较了20、30、50 min 等不同超声处理时间，结果超声处理20 min 的供试品色谱吸收明显弱于超声30 min 和50 min 供试品，超声处理30 min 的图谱与50 min 的图谱色谱峰数量、峰面积基本一致，提取30 min 后，各成份已基本提取完全。根据以上实验结果，选择以甲醇溶剂，超声提取30 min 作为提取方法。为获得理想的色谱条件，在供试品制备过程中，根据β-蜕皮甾酮等植物甾酮的理化性质，甲醇超声处理后，经水饱和正丁醇萃取和水洗涤等精制除杂步骤，样品中主要特征峰分离度良好，峰型对称。

3.3 色谱条件的选择

为获得更丰富的色谱峰信息，在实验中先后比较了乙腈-1%甲酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸溶液和甲醇-水等多种色谱系统和梯度洗脱程序，结果采用甲醇-水系统，按本文选定的时间程序洗脱，各色谱峰的分离度较好，且峰形对称性好。

3.4 扫描波长的选择

采用二极管阵列检测器在200 nm～400 nm 对供试品色谱进行全波长扫描，得到三维全波长紫外扫描图，结果表明在250 nm 波长处各吸收峰吸收均较强，且怀牛膝主要特征成分β-蜕皮甾酮在此处响应值较高，故选择250 nm 作为检测波长。

3.5 柱温的选择

考查了不同温度(室温、40 ℃、30 ℃)对色谱峰的影响，室温出峰时间较长，部分吸收峰有轻微拖尾，柱温40 ℃时出峰较迅速，1、2、4 号峰等主要色谱峰与相邻峰未能达到基线分离，30 ℃时色谱峰保留时间相应延长，但分离较好，出峰时间适宜，因此选择柱温为30 ℃。

3.6 道地与非道地产区怀牛膝β-蜕皮甾酮含量分析

运用SPASS 13.0 软件，对道地和非道地怀牛膝中β-蜕皮甾酮含量进行分析，道地产区药材含量高于非道地产区药材，通过F 检验结果显示，不同产地间怀牛膝中β-蜕皮甾酮含量无显著性差异。

3.7 不同等级怀牛膝中β-蜕皮甾酮含量分析

运用SPASS 13.0 统计学软件，对四个不同等级怀牛膝药材中β-蜕皮甾酮含量分别进行比较分析，结果发现，二等品＞三等品＞一等品＞四等品;在P=0.05 的水平下，四等怀牛膝中β-蜕皮甾酮含量与三等和二等怀牛膝中含量差异有统计学意义;其他水平间的含量差异无统计学意义。

3.8 建立怀牛膝药材的HPLC 指纹图谱

在实验中，对来自道地药材产区不同产地的怀牛膝进行指纹图谱研究，建立了怀牛膝中甾酮类成分的HPLC 指纹图谱对照图谱;通过对15 批来自不同产地的怀牛膝进行测定和分析，所建立的对照指纹图谱具有一定代表性，能够反映怀牛膝中β-蜕皮甾酮等甾酮类化合物的组成及相对比例，既可用于定性鉴别，又可起到半定量分析的作用，为河南道地药材怀牛膝的质量评价提供了新的科学方法和数据。

3.9 相似度分析

应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)进行图谱分析，结果表明，不同产地牛膝的相关系数有一定的差异。河南道地药材怀牛膝相似度均大于0.95，而河北、亳州等其他产地的牛膝的相似度则低于0.95，本实验所建方法可为区分道地药材和非道地药材提供一定的参考依据。

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