地奥司明对肾缺血再灌注大鼠肾组织MPO 和中性粒细胞CD11b、CD54 及CD62L 水平的影响*

袁 铭， 肖 漓， 许晓光， 高 钰， 钱叶勇， 石炳毅

(中国人民解放军第309 医院全军器官移植研究所，北京100091)

缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)引起的急性损伤肾组织中可发现明显的中性粒细胞浸润，同时伴有相关黏附分子如CD11b、CD54、CD62L 和P-选择素等增加，它们在组织炎症损伤过程中起着重要作用［1-2］。国内外研究证实地奥司明(diosmin，DOSM)具有抗炎症反应作用，它可能通过降低一些内皮细胞黏附分子的表达，在血管内皮细胞水平抑制白细胞的激活、迁移与黏附，减少炎症介质的释放，减轻脂质过氧化损伤［3-5］;本实验以SD 大鼠肾I/R模型为基础，以DOSM 作为干预手段，测定肾脏组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和血中中性粒细胞CD11b、CD54 和CD62L 的表达水平的变化。

材 料 和 方 法

1 材料

同龄健康雄性SD 大鼠180 只，体重200 ～220 g(北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK 京2007-0001)。DOSM 由南京正大天晴药业股份有限公司馈赠。大鼠MPO ELISA 试剂盒为R＆D 产品。抗CD62L-FITC、抗CD11b-FITC 和抗CD54-PE 单克隆抗体均为ABGAb 产品。

2 方法

2.1 动物分组及I/R 模型制备［5］SD 大鼠随机分为假手术(sham operation，SO)组、I/R 组和DOSM +I/R 组。3 组分别于术后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 和48 h 从下腔静脉采血后处死10 只大鼠，全血置于-80 ℃冰箱保存以备检测。取肾脏组织2.5 g，用磷酸盐缓冲液5 mL 制成匀浆，离心后取上清液置于-80 ℃冰箱保存待测。

2.2 肾脏组织中MPO 的测定 严格按照ELISA 试剂盒说明书进行定量测定。

2.3 流式细胞术检测CD11b、CD54 和CD62L 在中性粒细胞表面的表达 在每个流式检测管中加入50 μL 的荧光标记稀释后的Ⅰ抗(抗体用缓冲液稀释成合适的浓度);在空白管中加入50μL 缓冲液。每管分别加入100 μL 全血，并轻轻混匀。避光孵育15 ～30 min，进行直接免疫荧光染色。每管分别加入2 mL 红细胞裂解液，混合均匀。室温避光孵育10 min，异裂解红细胞，此孵育时间不要超过15 min。室温1 500 r/min，离心5 min，并弃去上清液。用2 mL 缓冲液洗涤细胞2 次。重悬细胞后上流式细胞仪分析。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，多组间比较用单因素方差分析，使用SPSS 12.0 软件包进行统计学分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 肾脏组织匀浆中MPO 活性的变化

SO 组肾组织匀浆中MPO 活性组内各时点比较无显著差异;与SO 组相比，I/R 组MPO 活性在1 h、3 h 和6 h 各时点明显升高，而在12 h 和24 h 开始下降，但仍高于同时点SO 组(P ＜0.01，48 h 组除外);DOSM+I/R 组MPO 活性也于1 h、3 h 和6 h 各时点明显升高，且在6 h 左右达高峰，此后在12 h、24 h 和48 h 明显降低，与 I/R 组相比差异显著(P ＜0.05 或P ＜0.01)，与SO 组相比无显著差异，见图1。

Figure 1. Changes of MPO activity in rat kidney tissues from different groups. Mean±SD. n =10. ＊＊P ＜0.01 vs SO group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs I/R group.图1 各组大鼠肾组织MPO 活性变化

2 不同时点大鼠血中性粒细胞CD11b、CD54 和CD62L 的表达

2.1 DOSM 对CD11b 的影响 结果见表1。CD11b在各组内自1 h 至6 h 均逐渐升高，并于6 h 达高峰，此后逐渐降低。在相同时点，I/R 组均显著高于SO组，差异显著(P ＜0.01)，各时点DOSM +I/R 组显著低于I/R 组(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

2.2 DOSM 对CD54 的影响 结果见表2。CD11b在各组内自1 h 至24 h 均逐渐升高，并于24 h 达高峰，此后逐渐降低。在相同时点，I/R 组均显著高于SO 组，差异有统计学意义(P ＜0.01)，各时点DOSM+ I/R 组显著低于I/R 组(P ＜0.05 或P ＜0.01)。各时点DOSM+ I/R 组与SO 组比较，除3 h 和24 h之外无显著差别。

2.3 DOSM 对CD62L 的影响 结果见表3。CD62L在各组内自1 h 至3 h 升高，并于3 h 达高峰，此后逐渐降低。在相同时点，I/R 组均显著高于SO 组，差异有统计学意义(P ＜0. 05 或P ＜0.01)，各时点DOSM + I/R 组显著低于I/R 组(P ＜0.05 或P ＜0.01)。自1 h 至12 h DOSM + I/R 组高于SO 组(P ＜0.05 或P ＜0.01)，此后2 组之间无显著差异。

表1 不同时点大鼠血中性粒细胞表面CD11b 的表达Table 1. The expression of neutrophil adhesion molecule CD11b in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

表2 不同时点大鼠血中性粒细胞表面CD54 的表达Table 2. The expression of neutrophil adhesion molecule CD54 in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

表3 不同时点大鼠血中性粒细胞表面CD62L 的表达Table 3. The expression of neutrophil adhesion molecule CD62L in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

讨 论

肾脏I/R 损伤的发生发展是一个极其复杂的病理生理过程，其发病机制涉及中性粒细胞浸润、氧化应激损伤、细胞凋亡等，并有众多炎性介质和免疫因子的参与［6-7］。我们曾研究发现在肾I/R 病理过程中促炎症细胞因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 和IL-8 的产生显著增加，而抗炎症细胞因子IL-10 的产生却减少［5］，同时肾组织的脂质过氧化反应显著增强［4］。因此减少中性粒细胞对组织细胞的黏附及相关炎症介质的释放对减轻I/R 损伤具有一定的作用［1］。

MPO 主要存在于中性粒细胞的噬天青颗粒中，是中性粒细胞的特异性酶，能催化产生多种活性氧化物质，导致氧化应激和氧化性组织损伤，其激活程度与中性粒细胞的浸润程度密切相关。CD54 又称为细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，是免疫球蛋白超家族的一员，是一组跨膜的单链糖蛋白，主要分布在白细胞、巨嗜细胞、血管内皮细胞等，是最重要的白细胞、内皮细胞间黏附分子之一。CD11b 是整合素家族中β2 亚族的一员，主要在中性粒细胞和单核细胞上表达，通过与内皮细胞表面的黏附分子如ICAM-1、E-选择素结合而介导白细胞与内皮细胞间相互作用。CD11b 受体密度上调是炎症反应的重要标志，可促进中性粒细胞和单核细胞黏附于内皮细胞、细胞外基质。CD62L 为L-选择素，表达于大多数中性粒细胞、单核细胞和嗜酸粒细胞，它介导白细胞与内皮细胞最初的滞留和滚动，尤其重要的是CD62L 还介导白细胞迁移到炎症部位，介导中性粒细胞相互之间的作用。

DOSM 是黄酮类化合物中的一种天然成分，在可食用植物、水果和蔬菜中，特别是在柑橘类水果的果皮中含量丰富，有增加静脉张力、促进淋巴回流、降低毛细血管通透性及增加毛细血管阻力的作用。目前临床上常将DOSM 单用或与橙皮苷复合作为血管保护药和静脉张力增强药应用于慢性静脉功能不全、静脉溃疡和急性痔疮的治疗［8］。DOSM 可通过降低一些内皮细胞黏附分子的表达，在毛细血管水平抑制白细胞的激活、迁移与黏附，减少炎症介质的释放，从而降低毛细血管的通透性。那么DOSM 是否具有抑制MPO 以及中性粒细胞表面CD11b、CD54及CD62L 等分子的表达而发挥抗炎作用?本实验以大鼠肾脏I/R 为基础，以DOSM 为干预治疗措施，观察到:(1)DOSM+I/R 组MPO 活性与I/R 组相比明显下降，与SO 组相比无显著差异，表明DOSM 可显著降低缺血再灌注肾脏组织MPO 的活性，提示DOSM 减少了中性粒细胞的浸润，从而发挥抗炎作用。(2)中性粒细胞CD11b、CD54 及CD62L 的表达在相同时点I/R 组显著高于SO 组，而在DOSM 组则显著低于I/R 组，说明DOSM 可显著降低CD11b、CD54 及CD62L 的表达。

本研究显示，肾I/R 后给予DOSM 治疗可显著减低MPO 活性，并显著降低中性粒细胞表面CD11b、CD54 及CD62L 等的表达，从而减少中性粒细胞对组织细胞的黏附浸润，抑制I/R 损伤的炎症反应。

(致谢:南京正大天晴药业股份有限公司提供资助!)

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［4］ 袁 铭，钱叶勇，韩 勇，等. 地奥司明对肾缺血/再灌注大鼠氧化应激及肾功能的影响［J］. 军医进修学院学报，2012，33(11):1171-1173.

［5］ 袁 铭，石炳毅，钱叶勇. 地奥司明对肾缺血/再灌注大鼠血清和肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-10水平的影响［J］. 中国病理生理杂志，2012，28(6):1066-1070.

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