黏着斑激酶在2 型糖尿病大鼠肾组织中的表达变化及意义*

李 霜， 王圆圆， 刘丽荣， 石 磊， 石明隽， 肖 瑛， 张国忠， 郭 兵

(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州 贵阳550004)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)作为一组遗传和环境相互作用引起的代谢综合征，患病率正逐年上升。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)已成为导致终末期肾衰竭及DM 病死率增加的重要原因，但DN 的发生机制仍未充分阐明。近来研究表明，黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)作为一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，在肝纤维化及心肌纤维化组织中表达增多和磷酸化增强，而FAK 的内源性抑制因子FRNK(FAK-related non-kinase)的表达却减少，提示FAK 在脏器纤维化过程中可能发挥重要作用［1-3］。但在2 型糖尿病(the type 2 diabetes mellitus，T2DM)中，肾组织中FAK 蛋白的表达变化及意义仍不清楚。我们前期研究发现，DM 大鼠血糖、血肌酐、血甘油三酯、血总胆固醇及24 h 尿蛋白量较对照组均显著升高，但血清胰岛素水平与对照组相比无明显差异;HE 染色下见正常组肾小球形态完整，轮廓清晰，肾小管未见异常;DM 16 周组大鼠肾小球体积增大和系膜基质增多，肾小管管腔扩张，上皮细胞脱落，部分肾小管基底膜不完整，间质可见炎症细胞浸润［4］。为此，本研究采用高脂高糖饮食加小剂量链脲佐菌素(streptozocin，STZ)腹腔注射的方法，复制大鼠T2DM 模型，并观察FAK 在T2DM 大鼠肾组织中的动态变化，探讨FAK 在DN 发病机制中的作用及可能机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠30 只，雄性，体重(200 ±20)g，由贵阳医学院实验动物中心提供，清洁级。

1.2 主要试剂 STZ 购自Sigma;纤维连接蛋白(fibronectin，FN)兔多克隆抗体、FAK 兔多克隆抗体、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)兔多克隆抗体和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)兔多克隆抗体购自武汉博士德公司;p-FAK(Tyr397)兔多克隆抗体购自博奥森生物技术有限公司;p-ERK1/2 兔多克隆抗体购自Santa Cruz;总RNA 提取试剂盒、2 ×Taq PCR MasterMix、1 500 bp DNA Marker 购自天根生化科技有限公司;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);胰岛素测定试剂盒购自天津九鼎生物医学工程有限公司;考马斯亮蓝测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;血糖、血肌酐、甘油三酯和总胆固醇测定试剂盒购自四川迈克科技有限公司;FAK 及β-actin 引物均由大连宝生物工程技术有限公司合成。两步法免疫组化检测试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Western 印迹用PVDF 膜和Whatman 3 mm 滤纸购自Millipor;超敏ECL 化学发光试剂盒购自碧云天生物研究所。

1.3 主要器材 强生稳步倍加型血糖仪(强生公司)，超低温冰箱(Sanyo)，高速低温离心机(Beckman)，电泳系统及电转移装置(Amersham)，凝胶成像系统(Bio-Rad)，梯度PCR 扩增仪(Bio-Rad)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，瞬时离心机(上海捷瑞公司)，Olympus 图象采集系统(Olympus)。

2 方法

2.1 糖尿病模型的制备和分组 将SD 大鼠随机分成正常对照组(NC，n =6)和高脂高糖组(HG，n =24)。大鼠适应性饲养1 周后，HG 组以高脂高糖饲料喂养，饲料组成如下:67%常规饲料、20% 蔗糖、10%猪油、2%胆固醇、1%蛋黄。喂养12 周时，称体重，测空腹血糖，尾动脉取血测血清胰岛素水平;HG组饲养12 周后又随机分为高脂高糖对照组(HC，n=6)和糖尿病组(DM，n =18)，DM 组大鼠按30 mg/kg剂量腹腔注射STZ (以pH 4.5、0.01 mol/L 无菌柠檬酸缓冲液配成1%浓度)。72 h 后测空腹血糖，血糖≥13.8 mmol/L 作为2 型糖尿病大鼠，18 只大鼠全部建模成功，成模大鼠随机分为糖尿病8 周组(DM8，n =6)、12 周组(DM12，n =6)和16 周组(DM16，n =6)。NC 组以常规饲料喂养，各组大鼠均自由饮水。

2.2 动物标本的采集 分别于实验的第20 周、24周和28 周(即糖尿病8、12 和16 周)处死DM8、DM12 和DM16 各组大鼠，于第28 周处死NC 和HC组大鼠。处死前1 d 代谢笼收集24 h 尿液，记录尿量。禁食6 ～8 h，麻醉后称体重，股动脉放血、收集血液，4 ℃离心，分离血清，-20 ℃保存;处死大鼠，开腹取肾脏，称重，一侧肾脏固定于4%多聚甲醛供制作石蜡切片用，另一侧肾脏于-80 ℃保存供Western blotting 和RT-PCR 检测。

2.3 免疫组化染色 采用免疫组化SP 法检测TGFβ1(1 ∶50)、FN(1 ∶100)、FAK(1 ∶50)、ERK1/2(1∶100)和p-ERK1/2(1∶100)在各组大鼠肾组织的分布和表达，PBS 作为阴性对照，DAB 显色，苏木素复染。蛋白阳性表达计数方法参考本实验室既往的研究［6］，计数10 个高倍视野(400 倍)，取均值。

2.4 Western blotting 检测 取-80 ℃保存的各组大鼠肾皮质，每组100 mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆、离心、取上清，用BCA 试剂盒(碧云天)测定各组蛋白质浓度，按所测得浓度计算每泳道所需体积，加入加样缓冲液煮沸10 min。经10% SDSPAGE 凝胶电泳分离，再转移至PVDF 膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，加入FAK、p-FAK (Tyr397)或β-actinⅠ抗，工作浓度分别为1∶150、1∶100 和1∶300，4℃孵育过夜。次日用TBST 洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(浓度均为1∶5 000)室温孵育1 h，ECL 化学发光试剂，暗室曝光，Bio-Rad 凝胶成像系统扫描胶片，Quantity One 软件分析各条带的面积和灰度值，两者乘积为积分灰度值，每个样本重复操作3 次。以同一张胶上 FAK 和 p-FAK(Tyr397)与相应的β-actin 条带所测积分灰度值的比值，即相对积分灰度值对FAK 和p-FAK (Tyr397)蛋白进行半定量。

2.5 RT-PCR 检测肾组织FAK mRNA 的表达

TRIzol一步法提取大鼠肾皮质的总RNA，核酸蛋白仪测RNA 的浓度和纯度(A260/A280均在1.8 ～2.0 之间)，取4 μg 肾组织总RNA 按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 说明进行逆转录，合成cDNA，-20 ℃保存备用。以cDNA 为模板进行FAK和β-actin(作为内参照)共同扩增。FAK 上游引物5'-ACTTGGACGCTGTATTGGAG-3'，下游引物5'-CCTGTTGCCTTTCTGGATAC-3'，产物985 bp;β-actin 上游引物5’-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’，下游引物5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGA-3’，产物490 bp。扩增条件:94 ℃预变性5 min，进入循环:94 ℃45 s，59.2 ℃45 s，72 ℃60 s，35 个循环后，再72 ℃10 min。反应产物做1. 5% 琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad 凝胶成像系统扫描，应用Quantity One 软件将各FAK 条带的吸光度值与β-actin 条带吸光度值的比值作为FAK 相对表达水平参数，进行半定量分析。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean ± SD )表示，采用SPSS19.0 软件处理，多组数据差异比较用ANOVA分析，两组间数据相关性比较用直线相关分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠一般情况

实验过程中，糖尿病大鼠呈现明显多尿、多饮、多食，生长缓慢，血糖维持在较高水平(≥13. 8 mmol/L)。单纯高脂高糖组大鼠无上述表现，体重增长显著，血糖无明显升高。

2 免疫组化结果

各组大鼠肾小管上皮细胞胞浆均可见FAK 蛋白表达，DM12 和DM16 组FAK 蛋白表达较NC 组和HC 组显著增加(P ＜0.05)，见图1。

TGF-β1在NC 和HC 组肾组织几乎无表达。DM8 组肾小管上皮细胞TGF-β1表达较NC 组和HC组显著增多(P ＜0.05)，表达随病程进展明显升高且持续高表达至DM16 组，见图1。

NC 和HC 组ERK1/2 在肾小管上皮细胞胞浆内表达，且有少量p-ERK1/2 表达，并可见核表达。随糖尿病进展ERK1/2 表达无明显增加，但DM8 组p-ERK1/2 在肾小管上皮细胞胞浆内的表达较NC 组和HC 组显著增多(P ＜0.05)，且核内表达也明显增多，并持续高表达到糖尿病形成后16 周，见图1。

各组大鼠肾组织中FN 沿肾小管基底膜呈线性分布。在NC 和HC 组肾组织中，FN 可见少量表达。DM8 组FN 表达增多且较NC 组和HC 组明显增加(P ＜0.05)，随病程发展逐渐增多，至DM16 组达到高峰，见图1。

3 Western blotting 结果

NC 组和HC 组大鼠肾组织有FAK 总蛋白和p-FAK(Tyr397)表达，两组无显著差异，DM8 组FAK和p-FAK(Tyr397)表达无明显增加(P ＞0. 05)，DM12 组和DM16 组FAK 和p-FAK(Tyr397)表达较NC 组、HC 组及DM8 组显著增多(P ＜0.05)，且p-FAK(Tyr397)与FAK 总蛋白表达趋势一致，见图2。

4 RT-PCR 结果

NC 和HC 组有FAK mRNA 表达，DM8 组无明显增加，DM12 和DM16 组FAK mRNA 比NC、HC 组及DM8 组表达明显增加(P ＜0.05)，见图3。

5 相关性分析

肾皮质中FAK 与TGF-β1、p-ERK1/2、FN 阳性蛋白表达随DM 病情进展呈增多趋势，相关性分析结果显示，DM12 和DM16 组FAK 与TGF-β1、p-ERK1/2、FN 呈显著正相关(r 值分别为0. 792、0. 558 和0.593，P ＜0.01)。

Figure 1. Expression of FAK，TGF-β1，ERK1/2，p-ERK1/2 and FN proteins in renal tubular cells of rats in each group (immunohistochemical staining，×400). Mean±SD. * P ＜0.05 vs NC group;△P ＜0.05 vs HC group.图1 FAK、TGF-β1、ERK1/2、p-ERK1/2 和FN 蛋白在各组大鼠肾小管上皮细胞中的表达情况

Figure 2. The expression levels of total FAK and p-FAK(Tyr397)in rat kidney tissues in each group detected by Western blotting. Mean ± SD. n = 6. * P ＜0.05 vs NC group;△P ＜0.05 vs HC group.图2 Western blotting 检测总FAK 和p-FAK(Tyr397)蛋白在各组大鼠肾组织中的表达

Figure 3. Expression of FAK mRNA in rat renal cortex in each group detected by RT-PCR. Mean ± SD. n =6. * P ＜0.05 vs NC group;△P ＜0.05 vs HC group.图3 RT-PCR 检测各组大鼠肾皮质FAK mRNA 的表达

讨 论

本实验采用高脂高糖饮食加小剂量STZ 的方法复制2 型糖尿病动物模型，DN 发展为慢性肾衰竭的最终通路是肾小球硬化及肾小管-间质纤维化，但其发病机制尚未充分阐明。TGF-β1是目前已知的致肾纤维化作用最强的多肽因子之一，它能诱导肾脏固有细胞表型转化及促进胞外基质(extracellular matrix，ECM)增生，在肾小管-间质纤维化进行性发展中起关键作用。TGF-β1主要通过激活Smad 通路发挥其致纤维化效应［5-6］，同时也可激活其它非Smad通路来促进纤维化病变的发生发展。黏着斑激酶FAK 是一种胞质非受体酪氨酸激酶，有多个酪氨酸磷酸化位点，其中Tyr397 是其自主磷酸化位点，不同的酪氨酸位点的磷酸化可为其它信号转导分子提供位点［7］。体外研究表明，TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞HK-2 能呈时间依赖性促进FAK 总蛋白及p-FAK(Tyr397)的表达，且p-FAK(Tyr397)表达趋势与FAK 相同［8-9］，Shikano 等［10］也发现1 型糖尿病大鼠肾小球内磷酸化FAK 与桩蛋白(paxillin，PL)表达增多，胰岛素治疗后，肾小球FAK 与PL 的表达明显减少，提示FAK 可能与糖尿病的发病有关。本研究结果显示，T2DM 大鼠成模后12 周肾小管上皮细胞中FAK 蛋白及mRNA 表达增加(P ＜0.05)且持续到16 周，p-FAK(Tyr397)表达趋势与总FAK 一致，同时DM12、DM16 组的肾小管上皮细胞中FAK 蛋白表达量与TGF-β1呈显著正相关(P ＜0.01)，提示FAK 可能参与TGF-β1致肾小管间质纤维化的过程。进一步研究发现，FAK 可能参与TGF-β1介导的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生和发展［9］，促进α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达增多、E-钙粘蛋白(E-cadherin)减少，使肾小管上皮细胞转分化成为肌成纤维细胞从而介导肾间质纤维化。Ding等［11］用TGF-β1刺激人及大鼠肺成纤维细胞后促使FAK、p-FAK(Tyr397)和α-SMA 表达增多，而用FAK的内源性抑制因子FRNK 转染肺成纤维细胞后，α-SMA 的蛋白表达量下降了约85%。本研究结果亦发现T2DM 大鼠肾组织的FAK 随着病程进展在蛋白和转录水平表达均明显增多的同时，肾间质ECM 主要成分FN 表达显著增多，提示在DN 病变过程中FAK 的表达增加，促进了TGF-β1介导肾间质ECM的沉积，使DN 的纤维化病变加重。

但TGF-β1究竟通过何种机制诱导了FAK 表达增加，目前尚不清楚。Walsh 等［12］用TGF-β1刺激IEC-6 细胞(大鼠空肠细胞)和Caco-2BBE 细胞(人结肠细胞)导致FAK 及p-FAK(Tyr397)的蛋白表达量增多后，运用siRNA 技术降低了Smad2 蛋白的表达，使TGF-β1促进FAK 蛋白总量表达增多的效应被阻断。同样使用p38 MAPK siRNA 降低p38MAPK蛋白的表达也抑制了TGF-β1诱导的FAK 蛋白总量表达增多的效应。这提示Smad 和p38 MAPK 信号通路在TGF-β1诱导的FAK 蛋白总量增加的过程中起到很重要的作用。而在2 种细胞类型的培养液中同时添加p38 MAPK 阻滞剂SB203580，Smad2/3 依然能被TGF-β1最大程度活化，提示p38 MAPK 并不是Smad 信号通路的上游分子，p38 MAPK 与Smad信号通路是独立的。推测TGF-β1通过p38 MAPK与Smad 信号通路促进FAK 蛋白的表达。有研究表明，当FAK 活化后可进入Ras 途径激活位于胞浆内的ERK1/2，被活化的ERK1/2(p-ERK1/2)迅速进入胞核内，可以使转录因子如AP-1 磷酸化进而增强FN 基因的转录活性，最终导致FN 的产生［13-14］。在本实验中，随着FAK 及其磷酸化水平的上调，虽然ERK1/2 总蛋白在NC、HC 和DM 各组大鼠肾小管上皮细胞中的表达无显著差异，但DM 各组大鼠肾组织中p-ERK1/2 的表达却显著升高(P ＜0.01)，进一步证实DM 肾组织中的ERK1/2 的活性明显高于正常对照组，但蛋白含量无明显变化［15］。DM 肾小管上皮细胞中p-ERK1/2 表达增多，可使AP-1 活化继而诱导肾间质FN 的生成增多，增加ECM 成分的表达;同时由于T2DM 大鼠肾组织中p-ERK1/2 与TGF-β1呈显著正相关(P ＜0. 01)，提示p-ERK1/2还可增强TGF-β1/Smads 信号通路的活性，参与了TGF-β1介导的肾间质纤维化的发病［16］。

总之，本研究表明，在2 型糖尿病时，FAK 可能作为TGF-β1的下游分子之一表达增多以及被活化，并通过活化ERK1/2 使FN 表达增多，从而参与了糖尿病肾病的发生发展。然而在DN 的发展过程中，FAK 表达的上调受哪些因素的影响以及TGF-β1究竟通过何种机制诱导FAK 表达增加，有待进一步研究证实。

［1］ 张晓岚，霍晓霞，申建刚，等. 黏着斑激酶酪氨酸磷酸化促大鼠肝纤维化形成［J］. 基础医学与临床，2007，27(2):143-147.

［2］ 刘小菁，傅 华，杨 丽，等. 肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞整合素α6β1及粘着斑激酶表达的变化［J］. 中华肝脏病杂志，2001，9(6):349-351.

［3］ Taylor JM，Rovin JD，Parsons JT. A role for focal adhesion kinase in phenylephrine-induced hypertrophy of rat ventricular cardiomyocytes［J］. J Biol Chem，2000，275(25):19250-19257.

［4］ 崔 龙，刘瑞霞，李晓颖，等.糖尿病大鼠肾脏病变及其SnoN 蛋白表达的变化［J］. 贵阳医学院学报，2009，34(1):16-20.

［5］ Hills CE，Al-Rasheed N，Al-Rasheed N，et al. C-peptide reverses TGF-β1-induced changes in renal proximal tubular cells:implications for treatment of diabetic nephropathy［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2009，296(3):F614-F621.

［6］ 杨 勤，谢汝佳，张国忠，等. 转化生长因子胞内信号蛋白Smad2/3 在糖尿病大鼠肾脏表达的动态观察及意义研究［J］. 中国病理生理杂志，2006，10(22):1879-1884.

［7］ Wong VW，Rustad KC，Akaishi S，et al. Focal adhesion kinase links mechanical force to skin fibrosis via inflammatory signaling［J］. Nat Med，2011，18(1):148-152.

［8］ 孙 勇，刘建国. 整合素与钙通道协同调节人肾小管上皮细胞转分化过程及其机制［J］. 山东医药，2007，47(8):7-9.

［9］ 邓冰清，朱忠华，张 春，等. 黏着斑激酶在转化生长因子β1 诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的作用［J］. 中华肾脏病杂志，2009，25(10):771-775.

［10］Shikano T，Haneda M，Toqawa M，et al. Tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase (p125FAK)and paxillin in glomeruli from diabetic rats［J］. Nihon Jinzo Gakkai Shi，1996，38(2):57-64.

［11］Ding Q，Gladson CL，Wu H，et al. Focal adhesion kinase(FAK)-related non-kinase inhibitis myofibroblast differentiation through differential MAPK activation in a FAK-dependent manner［J］. J Biol Chem，2008，283(40):26839-26849.

［12］Walsh MF，Ampasala DR，Hatfield J，et al. Transforming growth factor-β stimulates intestinal epithelial focal adhesion kinase synthesis via Smad-and p38-dependent mechanisms［J］. Am J Pathol，2008，173(2):385-399.

［13］Parsons JT. Focal adhesion kinase:the first ten years［J］.J Cell Sci，2003，116(Pt 8):1409-1416.

［14］Clark EA，Hynes RO. 1997 keystone symposium on signal transduction by cell adhesion receptors［J］. Biochim Biophys Acta，1997，1333(3):R9-R16.

［15］Fujita H，Omori S，Ishikura K，et al. ERK and p38 mediate high-glucose-induced hypertrophy and TGF-β expression in renal tubular cells［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2004，286(1):F120-F126.

［16］常巨平，祝胜郎，余学清，等. ERK1/2 信号蛋白在糖尿病小鼠肾组织中的表达［J］. 中国病理生理杂志，2007，23(9):1804-1807.