绿原酸对体外培养成骨细胞活性的影响

王朝元，易继凌，宋 超，魏甜甜，唐俊龙，杨光忠

(1 中南民族大学 生命科学学院，武汉430074；2中南民族大学 药学院，武汉430074)

接骨草(Sambucuschinensis)为忍冬科接骨木属，又名陆英、杜仲.主要分布于华北、华南、陕西、甘肃、四川、宁夏等省区.接骨草的根、茎、叶、花和果实均可入药，有祛风除湿、活血化瘀之功效.在传统中医药中，它可治疗风湿疼痛、痢疾、黄疸、慢性气管炎、风疹瘙痒、丹毒、跌打损伤和骨折[1，2]，目前关于接骨草防治骨质疏松和促进成骨细胞增殖的报道较多[3]，但其促进骨折愈合的有效成分尚不清楚.

绿原酸(chlorogenic acid ,CGA)是接骨草的化学成分之一，通常存在于杜仲、金银花、葵花籽粕等植物中[4，5].现有研究表明：CGA具有广泛的生理活性和药理活性，如利胆、抗菌、降压、增加白血球和兴奋中枢系统，抗肿瘤，清除自由基等[6-8].故本实验以成骨细胞MC3T3-E1为体外模型，研究CGA对成骨细胞活性、ALP活性和成骨分化相关基因的影响，以阐明其是否具有促成骨作用，为接骨草的临床应用提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

CGA(SIGMA-ALDRICH公司)，α-MEM培养基(Thermo赛默飞世尔生化制品有限公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25％的胰蛋白酶(Thermo)，青链霉素(Thermo)，DMSO(Amresco，0231)，MTT(Amerro)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白试剂盒(碧云天生物技术研究所)，反转录试剂盒(Thermo)，SYBR Green荧光染料(日本TOYOBO公司).

细胞培养瓶(美国Corning公司)，96孔、24孔、6孔培养板(美国Corning公司)，CO2培养箱(HF90/240型，利康生物医疗科技控股集团)，倒置显微镜(Motic AE21型，重庆光学仪器)，酶联免疫分析仪(MULTISKAN ASCENT 354型，thermo)，PCR仪(Biometra)，凝胶成像分析仪(JS-380A，上海培清科技)，荧光定量PCR仪(ABI，7500 fast).

1.2 不同浓度CGA的制备

称取0.05g CGA溶于50 mL α-MEM培养基(无血清)，配制成浓度为1 mg/mL的储备液.再用含10％血清的α-MEM培养基将CGA储备液倍比稀释为11.02,22.05,44.09,88.19μmol/L等处理细胞.

1.3 成骨细胞 MC3T3-E1的培养

取液氮冻存的成骨细胞MC3T3-E1复苏后，用含有10％胎牛血清的α-MEM完全培养基，置于37℃培养箱中培养，每隔3～4d更换1次培养基，待细胞90％铺满瓶底时，用0.25％的胰蛋白酶消化，按1︰2传代培养.

1.4 CGA对成骨细胞增殖率的影响

将生长状态良好的MC3T3-E1细胞以5×103/孔接种于96孔板中，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养.细胞贴壁后，分别加入含上述浓度CGA的培养基，设不加药为对照组，每组5个复孔，分别培养0,1,3 d后，每孔分别加入20 μL MTT，置于37℃，5％ CO2培养箱中进行培养，反应4 h，小心吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，吹打均匀后，在37℃培养箱中温育10 min，使其紫色结晶完全溶解，用酶标仪在492nm波长处测定其OD值.

1.5 CGA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响

将生长状态良好的成骨细胞MC3T3-E1按105/孔接种到24孔板中，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养.待细胞贴壁后加入22.05,44.09 μmol/L药物(该浓度下对成骨细胞增殖促进作用较好)设不加药为对照组，每组3个复孔，分别培养2,4,6 d后，按照ALP试剂盒和BCA蛋白试剂盒的操作步骤测定细胞中ALP活性.

1.6 CGA对成骨细胞成骨分化相关基因表达的影响

将生长状态良好的MC3T3-E1细胞按2×105/孔接种到6孔板中，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养.待细胞贴壁后加入药物，设不加药为对照组，每组3个复孔，分别培养2,4,6 d后，用Trizol法提取总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，并进行real-time PCR.反应条件：95℃，15s；60℃，15s；72℃，45s；40个循环.以看家基因GAPDH为内参，每个样品设3个复孔，采用2﹣ΔΔCt法[9]检测成骨分化相关基因的表达，不同骨相关基因PCR引物序列如见表1.

表1 荧光定量PCR引物序列

1.7 统计学处理

根据公式F=2﹣[(待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值)],计算出目的基因的相对表达量.用单因素方差分析(one-way ANOVA)对结果进行显著性差异分析.

2 结果与分析

2.1 CGA对成骨细胞增殖的影响

不同浓度CGA对成骨细胞增殖的影响结果见图1.如图1所示，CGA浓度为11.02～88.19μmol/L时，对成骨细胞的增殖均有较好的促进作用，选择22.05，44.09 μmol/L两个浓度用于后续实验.

1)control；2～5)依次为11.02，22.05，44.09，88.19μmol/L CGA

2.2 CGA对成骨细胞ALP活性的影响

CGA对成骨细胞ALP活性的影响见图2.由图2可见，培养2 d时，44.09 μmol/L的CGA能促进成骨细胞MC3T3-E1ALP活性的表达(P<0.01).培养4 d时，CGA对成骨细胞MC3T3-E1ALP活性无显著影响(P>0.05).随着培养时间的增加，培养至6d时，22.05、44.09 μmol/L CGA对成骨细胞ALP活性的影响具有抑制作用(P<0.05).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

2.3 CGA对成骨细胞成骨分化相关基因mRNA表达的影响

CGA对c-fos基因mRNA表达的影响见图3.由图3可见，培养2d时，2种浓度的CGA对c-fos基因的表达均有极显著促进作用(P<0.01)；4d时，44.09 μmol/L CGA对c-fos基因表达的影响逐渐由促进转为抑制(P<0.05)；6d时，22.05 μmol/L CGA对c-fos基因表达明显抑制(P<0.01)，呈时间依赖性.

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

CGA对c-jun基因表达的影响见图4.由图4可见，22.05 μmol/L CGA短期处理(2～4 d)不影响c-jun基因表达(P>0.05),长期处理(6 d)则表现为抑制作用(P<0.05).44.09 μmol/L CGA处理2 d可显著促进c-jun基因表达(P<0.01)，长期处理(4～6 d)则具有显著的抑制作用(P<0.01).故CGA对成骨细胞c-jun基因表达亦呈明显的时间依赖性.

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA 与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，n=3

CGA对Runx2基因表达的影响见图5.由图5可见，其影响呈明显的时间依赖性.22.05 μmol/L CGA培养2～4d时，对Runx2 基因的表达呈上调作用(P<0.01)，至6 d时，则表现为强烈的抑制作用(P<0.01).44.09 μmol/L的CGA在短期处理(2d)时，显著促进Runx2 基因的表达(P<0.01)，但是随着培养时间的延长，促进作用变成抑制(P<0.01)或没有显著影响(P>0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

如图6所示，CGA对osterix基因表达的影响也具有明显的时间依赖性.两种浓度的CGA短期处理(2 d)时，均极显著地促进Osterix基因的表达(P<0.01).随着培养时间的增加(4～6 d)，两种浓度的CGA处理对成骨细胞osterix表达的促进作用显著减弱，直至抑制作用(P<0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

如图7显示，与CGA对ALP基因表达的影响与osterix基因类似，也具有明显的时间依赖性.培养2 d，2种浓度的CGA均促进ALP基因的表达(P<0.05)； 4～6 d时，2种浓度的CGA对ALP基因的表达均具有不同程度的抑制(P<0.05).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

图8中CGA对Col-I基因表达的影响也呈明显的时间依赖性.但与CGA对Osterix和ALP基因表达的影响相反，随着培养时间的延长，CGA对Col-I基因表达的促进作用增强.在2～6 d，22.05 μmol/L CGA对Col-I基因表达的影响由抑制转为促进(P<0.01)；而44.09 μmol/L的CGA对Col-I基因表达的影响始终具有促进作用(P<0.05)，随着培养时间的增加，促进作用愈发显著(P<0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

3 讨论

MC3T3-E1细胞系是由C57BL/6小鼠颅骨细胞建株的成骨细胞，具有碱性磷酸酶活性，I型胶原合成和基质钙化等成骨细胞的生物学特性，常作为骨代谢研究的细胞模型[10].故本研究以MC3T3-E1细胞系来探讨CGA对成骨细胞增殖及活性的影响.

本实验中，11.02～ 88.19 μmol/L的CGA在不同的时间点对成骨细胞的增殖均具有一定的促进作用，以22.05,44.09 μmol/L的CGA在2个浓度的CGA进行进一步研究.

ALP的表达是成骨细胞分化早期的主要特征之一，是成熟成骨细胞的标志，其活性的高低可反映成骨细胞的活性状况[11].故本文研究了CGA对ALP活性的影响.在2～6 d，随着处理时间的延长，22.05 μmol/L CGA对ALP活性的影响由不影响变为抑制，44.09 μmol/L CGA对成骨细胞ALP活性的影响则由促进变为抑制，并与随后的CGA对ALP基因表达的影响结果一致.说明CGA对成骨细胞ALP活性的调控主要通过对其mRNA转录的调控来实现.

Runx2是干细胞向成骨细胞早期分化的重要标志基因，高表达Runx2可激活骨钙蛋白、骨桥蛋白和骨涎蛋白的转录和表达，从而促进成骨细胞成熟[12].Osterix是一种成骨细胞特异性表达的锌指结构转录因子,对成骨细胞的分化起着重要作用.Osterix转录受Runx2正性调控,直接促进前成骨细胞向成骨细胞分化.Osterix能调控许多重要成骨细胞晚期表型和功能蛋白的表达,如骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白及I型胶原[13].在本研究中，CGA对Runx2和Osterix基因的表达具有显著的时间依赖性，短期处理可以促进Runx2和OsterixmRNA的表达，随着处理时间的延长，则表现为抑制作用.这一结果说明CGA短期处理可能促进干细胞向成骨细胞的分化，而长期处理则不利于干细胞向成骨细胞的分化.

十分有意义的是，CGA可以促进成骨细胞Col-I的表达.I型胶原蛋白是成骨细胞分泌的骨主要有机成分，是成骨细胞的分化标志之一[14].本实验中，除了短期培养(2 d)时，低浓度(22.05μmol/L)的CGA对Col-I基因的表达具有一定抑制作用(P<0.05)，4～6 d，CGA均能显著促进Col-I基因的表达，并呈时间依赖性.说明合适浓度的CGA对成骨细胞成熟具有正向调控作用，有助于骨基质的形成和骨生长.

原癌基因c-fos产物与其他一些转录因子如c-jun表达的癌蛋白结合，形成活性蛋白-1(AP-1)，进而调控其他基因的转录，导致一系列生物学效应的产生，进而促进细胞的分裂增殖[15].在成骨细胞中，c-jun调控相关基因如骨钙素、I型胶原、碱性磷酸酶和组蛋白转录[16],故c-jun是调节成骨细胞增殖分化的基因之一.本研究中，CGA对c-fos和c-jun表达影响具有一定的复杂性，尚需进一步的研究阐明其机理.

综上所述，CGA具有调控成骨细胞增殖和分化的能力，CGA可促进成骨细胞的增殖，抑制成骨细胞ALP活性；CGA长期处理不利于干细胞向成骨细胞的分化，它通过促进I型胶原的表达而促进骨成熟分化.故CGA具有一定的成骨活性，是接骨草的成骨活性成分之一.

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