米诺环素辅助治疗牙周炎前后牙龈卟啉单胞菌的定量检测

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(1.大连医科大学 附属第一医院 口腔科，辽宁 大连116011；2.大连市疾病预防控制中心， 辽宁 大连 116000)

医学检验

米诺环素辅助治疗牙周炎前后牙龈卟啉单胞菌的定量检测

万君1，李秋红1，王如1，韩焱2，薄志坚2

(1.大连医科大学 附属第一医院 口腔科，辽宁 大连116011；2.大连市疾病预防控制中心， 辽宁 大连 116000)

目的对在基础治疗辅助米诺环素治疗慢性牙周炎前后，实时定量检测龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)占总细菌构成比。方法收集中、重度慢性牙周炎患者50例，根据随机、自身对照的原则设计分组：未用药侧和药物侧(药物侧牙周基础治疗后牙周袋内放置盐酸米诺环素)。记录治疗前、治疗后1、3个月时各项临床指标,并提取牙周袋内菌斑，应用TaqMan Real-time PCR方法对龈下菌斑进行定量检测，对数据做统计学分析。结果Pg构成比结果显示：两组治疗前均为68%，两组治疗后1个月未用药侧30%、药物侧28%；3个月时Pg构成比未用药侧24%，药物侧22%，均低于治疗前，差异有显著性意义(P<0.05)；用药侧与未用药侧Pg构成比治疗后3个月均低于治疗后1个月，差异无显著性意义(P>0.05);用药侧治疗后1、3个月与未用药侧比较，差异无显著性意义(P>0.05)。Pg构成比与临床指标探诊深度、出血指数和牙周附着水平成正相关性(P<0.05)。结论牙周病患者经基础治疗后能够减少龈下菌斑中Pg的构成比，而且可以在3个月内保持疗效，其中牙周基础治疗起关键性作用，盐酸米诺环素辅助用药对临床治疗效果的改善不明显。

牙龈卟啉单胞菌；实时定量PCR;米诺环素

牙菌斑生物膜是引发牙周疾病必不可少的始动因子。牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)已被认为是重要的牙周致病菌之一，Komiya等[1]报道其为红色复合体中重要的致病菌。

牙周病治疗计划第一阶段，即基础治疗/病因治疗，其目的为消除局部刺激因素和控制菌斑。基础治疗包括自我控制菌斑，洁治术、刮治术和根面平整术(scaling and root planing,SRP)，这是基础治疗最核心内容。而药物辅助治疗是患者愿意接受的治疗方法。目前多数学者认为米诺环素(Minocycline)[2]是牙周基础治疗中辅助SRP治疗最有前途的一种形式。商品名为派丽奥(Periocline)，通用名为盐酸米诺环素软膏是其中一种药物。

本研究对中、重度慢性牙周炎患者，进行牙周基础治疗，患者自身对照，一侧单纯牙周基础治疗，一侧牙周基础治疗后应用盐酸米诺环素(Minocycline)牙周袋上药。在治疗前后提取牙周袋内菌斑，应用Real-time PCR的检测方法对菌斑中牙龈卟啉单胞菌占细菌总量的构成比进行定量检测，通过研究，指导临床，以期获得良好的临床效果。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

试剂：牙龈卟啉单胞菌(Pg) ACTT 33277(四川大学口腔医学院馈赠)；盐酸米诺环素软膏(Sunstar株式会社，日本)；树脂型TM基因组DNA提取试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)；Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(宝生物工程大连有限公司)。

实验仪器：无菌超声波洁治器、Gracey刮治器(上海康桥齿科医械厂)；Wiliams牙周探针(上海康桥齿科医械厂)；无菌操作台(苏州亿达净化实验室设备有限公司)；Thermo Scientific IEC Multi/Multi RF 离心机(Thermo fisher，美国)；ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System(ABI Prism®，美国)。

1.2 病例采集

收集2010的3月—2012年3月大连医科大学附属第一医院就诊的慢性牙周炎患者50例，其中男23例，女27例；年龄20～65岁，平均43岁。每例患者选取左、右各1个位点，共100颗牙齿，100个位点。病例纳入标准：符合慢性牙周炎(CP)诊断标准：1999年新分类法[3]；无全身系统性疾病史；无吸烟史；3个月内无牙周病治疗史；1个月内无抗菌药和非甾体类抗炎药物服用史；妇女无妊娠、哺乳；无药物过敏史(尤其是四环素类药物)；患者知情同意。

1.3 指标测量标准及方法

主要临床指标：探诊深度(probing depth，PD)；出血指数(bleeding index,BI)；附着水平(attachment level,AL)。

实验前准备：对于符合实验要求的患者，经本人及家属知情同意后，建立牙周档案；行必要的辅助检查：如X线片、血常规等；根据患者自身条件，拟定治疗计划；进行口腔卫生宣教。如患牙伴有牙体牙髓病变、颌创伤等同期为其进行相应的治疗。

实验治疗计划：(1)龈上洁治后行牙周检查，记录各项临床指标。对于每位入选患者选取左右各1个位点，进行菌斑采集。位点选取标准:PD≥4 mm，AL≥3 mm。龈下菌斑采集方法：局部隔湿、吹干后，去除龈上菌斑，用无菌刮治器至待测位点牙周袋最深部，采集菌斑，装入标记好的无菌Ep管(含1 mLPBS)中。-20 ℃储存备用。(2)龈下刮治、根面平整。对于不同患者，根据个人情况行一次性或全口龈下刮治、根面平整。(3)设计分组：药物侧和未用药侧。依据随机、自身对照原则，按患者就诊顺序进行排列，查随机数表，若为单数则左侧位点为药物侧，右侧为未用药侧；双数相反。药物侧：牙周袋内使用盐酸米诺环素软膏，使用方法按照说明书要求，1次/周，疗程4周。4周后结束用药。未用药侧：无特殊处理。(4)再次牙周检查、采集菌斑：分别于牙周基础治疗后1个月、3个月后，相同位点，进行菌斑采集。记录各项临床指标，方法同前。

1.4 TaqMan实时荧光定量PCR检测

DNA提取：按照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取，-20 ℃储存备用。TaqMan实时荧光定量PCR检测：标准菌株为P.gingivalis ATCC 33277，由四川大学馈赠。引物设计：通用菌引物[4]和Pg的引物[5](表1)均由宝生物工程(大连)有限公司委托合成。标准曲线的制备：分别将通用菌和Pg标准品DNA按10倍梯度稀释作为模板,绘制标准曲线。反应体系 20 μL：Premix Ex TaqTM:10 μL；上、下游引物各0.4 μL；TaqMan探针：0.8 μL；ROX Reference Dye:0.4 μL;DNA模板：2 μL；ddH2O：6 μL。反应条件：变性温度95 ℃，30 s；退火温度95 ℃，5 s，进行40个循环；60 ℃延伸34 s，每个样本均做通用菌和Pg的定量检测。每次反应均设空白对照、阳性对照和梯度稀释的标准品。Pg构成比为Pg检测的量占通用菌检测的量的比例，用百分比表示。

表1 实时荧光定量PCR引物和探针

1.5 统计学方法

用统计分析软件包SPSS11.5进行数据处理，Pg构成比与PD、BI、AL数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法分析。Pg构成比与PD、BI和AL的关系用相关分析(correlation analysis method)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

治疗期间病例无失访，所有入试者均能够按时复诊，临床资料完整。

2.1 标准曲线和Pg检出率

本实验条件下通用菌和Pg标准品标准曲线和扩增曲线见图1,2,3,4。Pg检出率检测结果显示，两组治疗前Pg检出率均为68.0%，见表2。

图1 通用菌标准品标准曲线

图2 通用菌标准品扩增曲线

图3 Pg标准品标准曲线

图4 Pg标准品扩增曲线

表2 Pg检出率结果

2.2 Pg构成比

两组治疗后1个月、3个月均低于治疗前，差异有显著性意义(P<0.05)；每组治疗后3个月均低于治疗后1个月，差异无显著性意义(P>0.05)；用药侧治疗后1个月、3个月相对于治疗前减少的量大于未用药侧，但差异无显著性意义(P>0.05)。见表3。

表3 Pg构成比结果

1)与治疗前比较，P<0.05

2.3 临床指标的检测结果

两组治疗后1个月、3个月均低于治疗前，差异有显著性意义(P<0.05)；每组治疗后3个月均低于治疗后1个月，差异无显著性意义(P>0.05)；用药侧治疗后1个月、3个月相对于治疗前减少的量大于未用药侧，但差异无显著性意义(P>0.05)。见表4。

表4 临床指标的检测结果

1)与治疗前比较，P<0.05

2.4 Pg构成比与临床指标的相关性

Pg构成比与临床指标PD、BI和AL呈正相关。相关系数分别为r=0.999，r=0.997，r=0.952，P均<0.05。

3 讨 论

牙龈卟啉单胞菌是被公认为牙周病致病菌，检出率高。潘亚萍等[6]总结国内外对于慢性牙周炎中此菌的检出率，结果为28.0%～97.4%。本实验采用TaqMan Real-Time PCR方法，在治疗前两组的检出率为68.0%，检出率较高，同时也证实此菌在牙周病患者中的致病作用是不可忽视的。

近些年来对龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的微生物检测方法的研究很多，实时荧光聚合酶链式反应(Quantitative real-time PCR)技术已投入于口腔微生物的定量分析。Kawada M等[7]对Pg进行了定量分析，研究发现牙周基础治疗后细菌的数量明显减少，而且其数量与袋深呈显著正相关性，即牙周袋深每增加1 mm，细菌的数量会增加10倍。本实验的结果显示慢性牙周炎牙周基础治疗之后，其Pg构成比在治疗后1个月、3个月均低于治疗前。结果与Kawada M的结果有一致性。有研究发现慢性牙周炎患者牙龈卟啉单胞菌在基础治疗后12周时比6周时的相对含量有提高，差异有显著性意义[8]。而本研究结果在治疗后3个月时比1个月时Pg构成比要低，但差异无显著性意义。可能因为选择的位点牙周状况不同，患者的口腔卫生维护水平不同等原因。

本实验结果得出采用单纯SRP治疗与SRP和盐酸米诺环素辅助治疗两组，治疗前后Pg构成比差异无显著性意义，主要原因考虑为：一是构成比的减少不能完全代替细菌总量的减少，两组明显的Pg致病菌在总细菌比例的减少和消灭说明牙周基础治疗对菌斑中Pg毒性克隆株的感染控制是有意义的；二是本研究选取的患者为有深牙周袋的慢性牙周炎患者，此类患牙处于长期慢性感染状态，菌群生态环境不如急性期那样轻易打破，相当一部分患者经基础治疗后，还需要进入牙周手术[9]治疗阶段，彻底地清除龈下菌斑。

牙菌斑生态系统结构复杂，对于牙周病致病菌的感染控制临床医生目前主要采取的手段是机械性清除。而患者更欢迎药物的使用，特别是局部使用的缓释药物，具有局部区域药物浓度大，全身副作用小的优势。不能否认牙周基础治疗在牙周治疗中的重要意义，期盼有特效局部药物的应用让患者减少痛苦。

[1] Komiya Ito A,Ishihara K,Tomita S. Investigation of subgingival profile of periodontopathic bacteria using polymerase chain reaction[J]. Bull Tokyo Dent Coll，2010,51(3):139-144.

[2] Kim TS,Schenk A,Lungeanu D.Nonsurgical and surgical periodontal therapy in single-rooted teeth[J]. Clin Oral Invest， 2007,11(4):391-399.

[3] 曹采芳.临床牙周病学[M].北京：北京大学医学出版社，2006:24-28.

[4] Shelburne CE,Prabhu A,Gleason RM. Quantitation of Bacteroides forsythus in subgingival plaque comparison of immunoassay and quantitative polymerase chain reaction[J]. J Microbiol Methods，2000,39(2):97-107.

[5] Kimura S,Ooshima T,Takiguchi M. Periodontopathic bacterial infection in childhood[J]. J Periodontol，2002,73(1):20-26.

[6] 潘亚萍,刘静波. 牙龈卟啉单胞菌研究进展[J].国际口腔医学杂志，2011,38(2):125-127.

[7] Kawada M，YoshJda A. Prevalence of Porphyromonas gingivalis in relation to periodontal status assessed by real-time PCR[J]. Oral Microbiol Immunol，2004,19(5):289-292.

[8] 刘静波,林莉.牙周炎患者基础治疗后牙龈卟啉单胞菌的定植研究[J]. 国际口腔医学杂志，2008，43(8):478-482.

[9] Asi KS,Gill AS,Mahajan S.Postoperative bacteremia in periodontal flap surgery,with and without prophylactic antibiotic administration: A comparative study[J]. J Indian Soc Periodontol，2010,14(1):18-22.

Detectionandquantificationofporphyromonasgingivalisinchronicperiodontitisbeforeandafterminocyclinehydrochloridetherapy

WANJun1,LIQiu-hong1,WANGRu1,HANYan2,BOZhi-jian2

(1.DepartmentofDental,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.DalianCenterforDiseaseControlandPrevention,Dalian116000,China)

ObjectiveUsing the TaqMan Real-time PCR to compare between the scaling and root planting treatment (SRP) and SPR with minocycline hydrochloride for detection and quantification of Porphyromonas gingivalis (Pg) taken from subgingival plaque in moderate or severe chronic periodontitis.MethodsWe collected 50 cases of moderate to severe periodontitis patients,every patient's teeth were divided into two groups according to randomized control trial design as non-drug therapy (only SPR) and drug therapy (after SPR putting minocycline hydrochloride into periodontal pocket). To measure the Index at baseline before SPR. 1 and 3 months after SPR or SPR and drug treatment,subgingival plaque samples were collected and detected and quantified by the measurements of TaqMan Real-time PCR. To analyze the data using SPSS 11.5 software.Results(1)Constitution ratio of Pg of the two groups: before the treatment,the data of two groups were 68%; after treatment 1 month the SPR group was 30%,SPR with minocycline was 28%,3 month the SPR group was 24%,SPR with minocycline was 22%,after treatment 1 month and 3 month were reduced comparing with the one before treatment,the result was statistically significant (P<0.05). Constitution ratio of Pg of the two groups after treatment 3 month was below the one of 1 months after treatment,the result was no statistically significant (P>0.05). Constituent ratio of Pg between the two groups showed no difference before and after the treatment 1 and 3 mouths,the result was no statistically significant (P>0.05).(2)The relationship between constituent ratio of Pg and the clinical index such as PD,BI and AL showed positive correlation,the result was statistically significant (P<0.05).ConclusionPeriodontal disease which is treated by SPR treatment or SPR with minocycline hydrochloride will reduce the number of Pg in subgingival plaque,and can maintain a therapeutic effect in three months. the SRP treatment plays a critical role and the improvement of clinical treatment effect using minocycline hydrochloride shows no obvious.

porphyromonas gingivalis (Pg); real-time quantitation PCR; minocycline

10.11724/jdmu.2013.06.23

R781.404

A

1671-7295(2013)06-0603-04

万君，李秋红，王如，等. 米诺环素辅助治疗牙周炎前后牙龈卟啉单胞菌的定量检测[J].大连医科大学学报，2013,35(6)：603-606.

万 君(1971-)，女，辽宁抚顺人，主治医师。E-mail：wj-826@163.com

李秋红，副教授。E-mail:dlliqiuhong@126.com

2013-06-27；

2013-09-05)