蟛蜞菊挥发油成分体外抗菌活性研究

林曾欢林碧芬黄志坚

（1.福清市畜牧兽医中心 福建福清 350300；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；3.福建农林大学动物科学学院 福州 350002）

蟛蜞菊（Wedelia chinensis），为菊科(compositae)蟛蜞菊属(wede1ia)植物，多年生草本，《中药大辞典》记载：清热、解毒、祛癖、消肿，主治白喉、百日咳、痢疾、痔疮、跌打损伤［1］。蟛蜞菊已作为草药在中国南方民间被广泛应用，特别在福建和广东地区。其不仅资源丰富，且富含萜类、生物碱、黄酮类物质等多种生物活性成分，具有显著的抗炎、止咳、抑菌、保肝疗效，安全方便，是一种良好的中草药资源［2-4］。

随着我国畜禽养殖业的发展，畜禽致病菌多重感染、抗生素长期大量使用带来的畜禽产品安全问题日益突出，如肠道菌群失衡、毒副作用、耐药性及其传递转移等负效应。因此，探索与研制抗菌活性高、毒性低、残留少的广谱饲料抗生素替代品，以提高细菌多重感染性疾病的控制水平和畜禽产品的质量安全已成为21世纪健康养殖的重要课题。

研究证明，挥发油(essentia1oi1)的活性成分具有较强的表面活性和脂溶性，能迅速穿透病原微生物的细胞膜，使其内容物流失，并能有效阻止线粒体内的呼吸氧化过程，使病原微生物丧失能量供应而死亡［5］。目前，挥发油也已作为饲料添加剂被应用于畜牧生产中，围绕各种挥发油进行的试验也成为了当前饲料添加剂研究的热点之一［6-7］，但有关蟛蜞菊挥发油作为抗生素替代品应用于饲料中的研究较少。本研究以4种病原菌为对象，研究了蟛蜞菊挥发油的抑菌效果，为其作为饲料抗生素替代品的开发利用提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

1.1.1 植物原材料 蟛蜞菊地上部分采自福建农林大学。

1.1.2 供试菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）；金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）；葡萄球菌（Staphylococcus sp.）；沙门氏菌（Salmonella sp.）购于中国药品生物制品检定所。

1.1.3 主要试验设备和药品 挥发油水蒸汽提取装置，正茂玻璃仪器厂；LRH-150生化培养箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（洁净度100级），苏州净化设备有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；TGL-16G台式高速冷冻离心机，上海安亭科技仪器厂；JEM—1010型透射电电子显微镜，日本电子株式会社。乙醚、95%乙醇、氯化钠、硫酸钠等均为分析纯。

1.1.4 培养基配制 肉汤培养基：肉汤培养基1.1 g，50 mL蒸馏水，121℃灭菌30 min备用；琼脂培养基：琼脂培养基4.5 g，100 mL蒸馏水，121℃灭菌30 min备用。

1.2 试验方法

1.2.1 蟛蜞菊挥发油的提取 准确称取2 000.0 g新鲜蟛蜞菊地上部分，切成1～2 cm碎片，置于挥发油水蒸汽提取装置中，按水蒸汽蒸馏法进行蒸馏4 h，收集挥发油，经NaC1饱和后用乙醚萃取3次，萃取液用无水硫酸钠干燥，过夜，蒸馏回收乙醚后冷藏备用。

1.2.2 抑菌活性的测定

1)抑菌原液样品制备。取蟛蜞菊挥发油，用95%乙醇溶解稀释成含挥发油50 mg/mL的药液，滤菌备用。

2)抑菌圈测定（滤纸片扩散法）。将直径为6 mm的圆滤纸片经高压灭菌后在50 mg/mL的挥发油药液中浸渍10 min备用。将浓度为105CFU/mL的各试验菌悬液0.2 mL在相应的固体培养基上均匀涂布，制成含菌平板。取浸渍过的滤纸片贴于不同的含菌平皿上，用稀释10-4倍的庆大霉素作阳性对照，用95%乙醇作阴性对照，将各培养皿置于37℃生化培养箱中培养24 h后。精确量取抑菌圈直径，结果取4次重复试验的平均值。

3)最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌溶度（MBC）测定。将蟛蜞菊挥发油加到2 mL 1.0×105CFU/mL各试验菌悬液中，使挥发油最终稀释浓度为70、60、50、40、30 mg/mL，同时设细菌对照组和空白对照组，置于37℃生化培养箱中培养24 h后观察结果，以无菌生长的最低浓作为该供试菌种的最小抑菌浓度。

从MIC试验无菌生长的试管中吸取0.05 mL液体加入到0.15 mL肉汤培养基中混和均匀（通过稀释法解除残留药物的抑菌作用），吸取0.1 mL到固体培养基中涂布均匀。将培养皿正面向上放入37℃生化培养箱中培养约0.5 h后，待表面干燥将培养皿倒扣继续培养至24 h，以完全无菌生长的最低浓度作为该供试菌种的最低杀菌浓度。

2 结果与分析

由表1可知，蟛蜞菊挥发油对4种供试细菌都有较好的抑制作用，表现出良好的广谱抗菌效果，其中以对大肠杆菌的抑制作用最强。结果显示，蟛蜞菊挥发油对沙门氏菌的最小抑菌浓度为40 mg/mL，其他的则为50 mg/mL。根据文献（刘洋等，2009），蟛蜞菊挥发油对供试菌种的MIC都介于7.81～250 g/L，为中度敏感。

表1 蟛蜞菊挥发油对7种供试菌的抑菌圈和MIC、MBC

3 讨论

蟛蜞菊挥发油对常见的畜禽病原菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、葡萄球菌和沙门氏菌都具有良好的抑制效果，显示出广谱的抗菌效果。虽然与抗生素相比，蟛蜞菊挥发油的抑菌效果较差，但是抗生素在畜牧养殖生产中滥用造成的药物残留不仅严重影响畜产品的质量，且导致多重耐药与交叉耐药性，更严重威胁着人类的健康。而植物本身所具有的低毒、低残留、低耐药性等特性是抗生素所不具备的。因此，研究开发蟛蜞菊挥发油作为饲料添加剂具有一定的生产意义，但是其具体抗菌成分和抗菌机制尚未明确，需要进一步深入研究。

［1］江苏新医学院.中药大辞典(下册)［M］.上海:上海科技出版社，2002:2701.

［2］宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典(上册)［M］.北京:人民卫生出版社，2001:2456-2457.

［3］ 谢宗万.汉拉英对照中药材正名词典［M］.北京:北京科学技术出版社，2004:766.

［4］ 梁方方，莫毅，赖志强，等.蟛蜞菊对小白鼠的急性毒性试验［J］.中国畜牧兽医，2009，36(3):223-225.

［5］ 姚新生.天然药物化学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2002:245-246.

［6］ Hayashi K，Imanishi N，Kashiwayama Y.Inhibitory effect of cinnama1dehyde，derived from Cinnamomi cortex，on the growth of inf1uenza A/PR/8 virus in vitro and in vivo［J］.Antivira1Research，2007，74:1-8.

［7］ Chung-Jen Chen，Martin Michae1is，Hseng-Kuang Hsu.Toona sinensis Roem tender 1eaf Extract inhibits SARS coronavirus rep1ication［J］.Journa1of Ethnopharmaco1ogy，2008，120:108-111.