PCNA与兔蛛网膜下腔出血模型血管痉挛发生发展的关系

李王安 荆国杰 姚晓腾 林 才

广东惠州市第一人民医院神经外科 惠州 516003

脑血管痉挛（CVS）是蛛网膜下腔出血（SAH）患者致死和致残的主要原因之一，常于SAH 后3～5d出现，发生率达45%［1］。过去数十年，不断有学者从细胞、分子水平对脑血管痉挛的发病机制作出阐述［2-4］，但至今尚未完全阐明。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作为各种细胞增殖的指标可敏感反映细胞增殖活性。自Harrison 等［5］发现SAH 患者CSF中与调节细胞增殖有关的多种血管有丝分裂原呈异常表达以来，血管细胞增殖与脑血管痉挛的关系逐渐引人关注［6-7］。我们利用兔SAH 模型，采用免疫组化方法观察了SAH 后脑基底动脉壁PCNA 的表达，以探讨血管细胞增殖在脑血管痉挛发生中的作用和意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 选用健康新西兰大白兔（广东省实验动物中心提供）30只，体质量2.5～3.0kg，雌雄不限。6只用于预实验。其余随机分为SAH 组、假手术组和正常组3组，各8只。

1.2 动物模型的建立 兔用氯胺酮（30mg／kg）肌内注射麻醉后以俯卧头低位固定于动物立体定位仪，行枕部穿刺缓慢放出清亮脑脊液2mL，同时抽取2mL未抗凝自体新鲜动脉血缓慢注入枕大池。保持原体位30min，48h后重复上述过程［1］。假手术组则以生理盐水代替自体动脉血注入枕大池，正常组不予任何处理。

1.3 标本制作及病理观察 各组动物于SAH 后第5天采用心脏灌注法处死并取材：氯胺酮麻醉后开胸，充分暴露心脏及主动脉，将套管针从左心室插入升主动脉，固定套管开始灌注（灌注压120cmH2O），同时剪开右心耳放血。先灌注0.9% NS，待右心流出液接近无色时，改为灌注4%多聚甲醛固定液（pH 7.4）。灌注完后即开颅取基底动脉中段以4%多聚甲醛固定备用。常规脱水，石蜡包埋，修蜡切片。标本切片部分行HE 染色，光镜（NIKON E1000 生物显微镜）观察并摄影，采用德国Sigma Scan Pro 4.0病理图像分析系统进行测量血管横截面积。免疫组化检测采用PCNA 抗体（武汉博士德生物工程有限公司提供）行SABC 法染色（操作流程按试剂说明书），定位于血管壁及邻近脑膜细胞核内，阳性细胞核染色为棕褐、棕黄色。以结肠癌细胞增殖核抗原作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，每个标本取2张切片，每张切片随机取3个高倍视野计数全部细胞，以阳性细胞为分子计算PCNA 表达指数百分比。

1.4 统计学分析 用SPSS 13.0 软件包进行数据处理。采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体及形态学观察结果 SAH 后第5天，肉眼见假手术组和正常组兔后颅窝各脑池内充满清亮脑脊液，无血凝块残留；光镜下基底动脉血管结构正常，管壁无增厚，管腔呈圆形或椭圆形，2组管腔横截面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）。SAH 组各兔后颅窝各脑池内残留大小不等的暗红色血凝块，以基底池较重，周围蛛网膜部分粘连；光镜下基底动脉发生明显的病理变化（图1）：管壁增厚、管腔狭小，平均管腔横截面积分别为假手术组的46.4%、正常组的44.8%，差异均有统计学意义（P＜0.01）；内皮细胞变形、部分胞浆可见空泡；内弹力膜明显迂曲皱折、厚薄不均；平滑肌细胞排列紊乱、部分胞核浓缩深染、核周间隙增宽；外膜细胞增多，可见炎症细胞。

2.2 PCNA 染色结果 术后第5天假手术组及正常组基底动脉管壁PCNA 表达不明显，2组间PCNA 阳性细胞指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而在SAH 组血管外膜及邻近脑膜中有强表达（见图2），阳性细胞核染色多为棕褐色，与前2组相比PCNA 阳性细胞指数差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

图1 兔SAH 后第5天基底动脉HE 染色结果A：SAH 组（×100）；B：正常组（×100）；C：A 图局部放大（×400）；D：B图局部放大（×400）

图2 兔SAH 后第5 天基底动脉免疫组化染色结果A：SAH 组基底动脉管壁PCNA 染色（核呈棕褐色者为阳性细胞）（×100）；B：假手术组基底动脉管壁PCNA 染色（×100）；C：A 图局部放大（×400）

表1 术后第5天基底动脉管壁PCNA 染色结果 （±s）

表1 术后第5天基底动脉管壁PCNA 染色结果 （±s）

注：P 值为各组与正常组比较

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3 讨论

SAH 后有多种致痉物质出现，尤其是血液降解产物，如氧合血红蛋白（OxyHb）、胆红素和高铁血红蛋白等，各种刺激因子作用于血管内皮细胞和平滑肌细胞，导致早期的脑血管急性痉挛［8］。若急性痉挛未被逆转，痉挛的脑血管发生结构改变［9］，如细胞坏死、胶原沉积、纤维变形、平滑肌细胞和肌纤维母细胞增殖，这些改变导致病变动脉壁增厚、血管顺应性降低。本研究利用光镜观察SAH 组基底动脉常规HE染色后血管壁的改变也证实了这一点，Borel等［10］在2003年首次报道在小鼠枕大池注血后72h基底动脉及周围脑膜组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达较对照组显著增多，且痉挛血管发生的增殖与临床及影像学观察到的脑血管痉挛有密切关系。PCNA 位于细胞核内且仅在S期出现，S期结束时消失，所以又称细胞周期蛋白，是S期的特异性标记。PCNA 作为各种细胞增殖的指标可敏感反映细胞增殖活性，其表达量可客观反映细胞增殖的数量及分布。一般来说，成年个体血管平滑肌细胞在生理情况下增殖率很低，无明显增殖表现。本实验中，我们发现假手术组和正常组基底动脉管壁PCNA 表达很弱，而SAH 组兔基底动脉管壁外膜及邻近脑膜上PCNA 有强表达（与对照的2 组相比PCNA 阳性细胞指数差异有统计学意义），但中膜及内膜较少，这与Borel等［9］观察结果相似。我们认为这主要是因为兔SAH 模型血液是由枕大池注入而非由血管壁破裂后引起，聚积在血管周的血凝块及其产物主要刺激血管外膜及周围组织，继而触发大量促进血管细胞增殖的生长因子释放，最终导致血管外膜纤维母细胞、血管周围脑膜组织及部分中膜平滑肌细胞发生增殖，细胞核内PCNA 表达增强。

然而，血管细胞增殖与脑血管痉挛的临床或影像学征象之间的关系至今还无法定论。可能血管壁各层细胞及邻近组织发生增殖后血管壁逐渐增厚，反过来又导致血管不可逆的僵硬、弹性和柔韧性下降、管腔狭窄、血供减少，最终发生迟发性脑血管痉挛、脑缺血而引起神经功能障碍。本研究发现，SAH 后PCNA 的表达强度与脑血管痉挛的发生及基底动脉管壁管腔的病理改变有密切关系，提示血管细胞增殖及其导致的血管壁增厚在脑血管痉挛发生、发展中可能具有重要意义。

［1］Jeon H，Ai J，Sabri M，et al.Neurological and neurobehavioral assessment of experimental subarachnoid hemorrhage［J］.BMC Neuroscj，200910：103.

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［5］Harrison P，Cramer EM.Platelet alpha-granules［J］.Blood Rev，1993，7（1）：52-62.

［6］罗卫，马泽，沈冰.大鼠蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛和血管壁增殖关系的实验研究［J］.中风与神经疾病杂志，2008，25（6）：666-668.

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［9］Macdonald RL.Pathophysiology and molecular genetics of vasospasm［J］.Acta Neurochir Suppl，2001，77：7-11.

［10］Borel CO，McKee A，Parra A，et al.Possible role for vascular cell proliferation in cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage［J］.Stroke，2003，34：427-433.