针刺干预大鼠胰岛素抵抗及下丘脑胰岛素受体后IRS1 及其酪氨酸磷酸化的研究

何军锋，严洁，黄惠勇，王超，李江山，谢梦洲，屈娅婷

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

随着人们生活水平的不断提高，肥胖症的发病率日益增高，其并发症，如糖尿病、心血管疾病、癌症等已成为严重影响人类健康的世界性医学难题［1］。由于利用高脂饮食建立动物模型(DIO)与人类肥胖的自然过程相近，进而成为研究肥胖症的重要方法之一。针灸减肥具有简便有效，且无不良反应等优点［2］，因而备受关注。本研究拟观察针刺足阳明经穴对DIO大鼠胰岛素抵抗及下丘脑胰岛素受体后IRS1的影响。

1 材料和方法

1．1 模型建立

SD雄鼠(购于湖南中医药大学)，体质量50～70g。适应性喂养1周，随机分组:正常对照组(A组)10只，给予普通饲料(由湖南中医药大学实验动物中心提供);实验组60只，给予高脂饲料［3］(由湖南中医药大学实验动物中心提供)。自由进食饮水，室温21～24℃。每2周称重并记录，进行体重(BW)分析。大鼠肥胖判断标准:凡经高脂饲料喂养12周后，SD大鼠的BW超过普通饲料喂养大鼠BW的20%作为实验肥胖大鼠。

1．2 动物分组及干预

SD肥胖大鼠模型建立后，取30只肥胖大鼠，随机分为肥胖模型组(模型组)、肥胖模型+针刺足阳明经穴(针刺组)、针刺非经穴组(非经穴组)，每组10只。针刺组将清醒大鼠固定于特制的装置，取单侧四白、天枢、足三里、内庭穴(隔天交替针另一侧)，局部75%酒精常规消毒后，针入3～5mm，接通电针仪，频率为10Hz，强度3mA，以胡须及肢体微动为度，时间15min，每天治疗1次，治疗6天休息1天，持续4周。穴位的定位参照《实验针灸学》常用实验动物针灸穴位。针刺非经穴组在固定大鼠后选择四白、天枢、足三里、内庭穴旁开非经穴点针刺;正常组、模型组则行抓取固定，不作任何治疗，持续4周。

1．3 指标检测

1．3．1 血清生化指标检测 大鼠取血前需过夜禁食8h，准确测量体质量(BW)，内眦静脉采血，使用强生牌稳豪血糖仪测定空腹血糖(FPG)，离心分离血清，－80℃保存。放免法测定FINS水平。HOMA－指数(HOMA－index):(FINS×FPG)/22．5。

1．3．2 蛋白检测 采用Western blot法［4］。－70℃冰箱里取出大鼠下丘脑组织，用细胞裂解液裂解，进行超声萃取后测定总蛋白浓度。分装后置于－20℃冰箱保持。SDS－PAGE分离蛋白，转置PVDF膜(Pierce产品)。5%的牛奶TBS－T封闭PVDF膜后，予Upstate公司的IRS1 及IRS1 抗磷酸酪氨酸抗体结合膜蛋白，4度摇床过夜;TBS－T洗膜后加HRP二抗，洗膜3次;PVDF膜予ECL法显色后，X－胶片曝光，以 β－actin为对照，置于光密度仪下检测IRS1 及酪氨酸磷酸化的相对含量。

1．4 统计处理 用SPSS 13．0 统计软件处理，所有数据用均数±标准差表示，多组均数比较用方差分析。

2 结果

2．1 体质量变化 高脂饮食喂养12周后，模型组大鼠体质量达(524．32±34．18)g，显著高于空白组与针刺组(P ＜0．05 或 P＜0．01)，但与非经穴组比较，无显著差异。针刺足阳明经穴组能显著抑制高脂模型大鼠体质量，与非经穴组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化比较(±s，n=10)

表1 各组大鼠体质量变化比较(±s，n=10)

注:与空白组比较，*P ＜0．05;与模型组比较，●P ＜0．05，●●P ＜0.01;与非经穴组比较，○P ＜0．05。

空白组 56．12 ±5．18 467．12 ±28．15●●○模型组 58．64 ±6．85 524．32 ±34．18*针刺组 59．22 ±7．25 480．23 ±30．75＊●○非经穴组 55．46 ±4．25 512．45 ±35．25*

2．2 干预后各生化指标比较 与空白组比较，模型组及非经穴组空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、HOMA－指数(HOMA－INDEX)均显著升高(P＜0．01)。针刺组大鼠FPG、FINS、HOMA－INDEX均显著下降，与模型组及非经穴组比较，差异具有统计学意义(P＜0．01)。见表2。

空白组 4．56±0．97●○ 8．55±3．45●○ 1．88±1．22●○模型组 7．65 ±1．05* 15．43 ±3．28* 5．15 ±1．31*针刺组 5．22±0．86●○ 8．38±3．57●○ 2．16±1．19●○非经穴组 7．26 ±0．77* 13．89 ±2．25* 4．85 ±1．45*

2．3 各组IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化水平

IRS－1 蛋白表达由低到高依次为模型组、非经穴组、针刺组、空白组;各组组间比较，并无显著性差异(P＞0．05)。肥胖模型组及非经穴组IRS－1 酪氨酸磷酸化水平较低，空白组和针刺组均显著高于模型组和非经穴组(P＜0．01)，提示针刺足阳明经穴可显著改善肥胖模型的IRS－1 酪氨酸磷酸化水平。见表3。

表3 IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化比较(±s，n=10)

表3 IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化比较(±s，n=10)

注:与空白组比较，*P ＜0．01;与模型组比较，●P ＜0．01;与非经穴组比较，○P ＜0．01。

空白组 94．12 ±9．18 132．22 ±11．24●○模型组 85．44 ±8．85 110．23 ±12．65*针刺组 90．282 ±10．25 128．64 ±12．45●○非经穴组 87．45 ±7．89 114．14 ±11．98*

3 讨论

以高脂饲料喂养大鼠是建立饮食诱导肥胖模型最常用的方法，这与人类肥胖发生的特点相似［5］。肥胖患者内分泌代谢紊乱，普遍存在着高胰岛素血症，提示机体胰岛素敏感性下降，存在严重的胰岛素抵抗。胰岛素经血液循环到达靶组织，并与其上的胰岛素受体α亚单位结合，激活胰岛素受体β亚单位从而发生自磷酸化。被激活的胰岛素受体β亚单位进一步磷酸化细胞内信号分子IRS－1，后者被磷酸化后表现出一种特异性结合位点，能募集并激活下游含有SH2 区域的蛋白质，使得信号以激酶链式反应下传。IRS－1 作为胰岛素受体信号转导起始的一个重要信号分子，其蛋白表达及酪氨酸磷酸化程度的降低可引起胰岛素生物效应的减弱，最终引起胰岛素抵抗［6］。

中医学认为，足阳明胃经在能量代谢中起着枢纽作用。在针刺减肥的研究中，足阳明胃经的穴位天枢、足三里、内庭是最常用的腧穴［7］。蔡氏［8］的研究表明，针刺足三里、内庭和胰俞，可显著上调2型糖尿病大鼠肝组织IRS1 mRNA表达。我们前期研究表明，足阳明经的四白穴与胃肠运动密切相关且两者传入信息可以在中枢汇聚［9－10］，它可能在肥胖研究中有着重要的作用。因此，本研究中选择足阳明经穴这四个腧穴作为研究对象。针刺足阳明经穴的结果表明，这四个腧穴可显著抑制高脂饮食诱导的肥胖，同时可较好地改善肥胖模型的胰岛素抵抗状态。此外，让人感兴趣的是，针刺足阳明经四白、天枢、足三里和内庭，尽管对于IRS－1 蛋白表达并无显著的提高，却可显著提高IRS－1 酪氨酸磷酸化水平，这与叶氏用中药干预的结果颇为类似［11］，这意味着针刺可改善受体后信号传导通路中的磷酸化水平，值得进一步研究。

［1］ He JF，Wong SS，Qu YT，et al．Obesity－Related Mechanism of Food Intake Suppression［J］．Journal of Brain Science，2011，36:61－80．

［2］ 赵强，冯伟．针刺治疗单纯性肥胖取穴规律的临床研究［J］．天津中医药大学学报，2011，30(2):95－97．

［3］ 孙志，张中成，刘志城．营养性肥胖动物模型的实验研究［J］．中国药理学通报，2002，18(4):466－467．

［4］ 刘向阳，都健，王惠敏，等．胰岛素抵抗大鼠肝脏丝氨酸/酪氨酸磷酸化IRS－1 表达异常与脂联素相关的研究［J］．中国医科大学学报，2009，38(4):250－252．

［5］ Moraes JC，Coope A，Morari J，et al．High－Fat Diet Induces Apoptosis of Hypothalamic Neurons［J］．PLOS ONE，2009，4(4):5045．

［6］ Van Eijk M，Aten J，Bijl N，et al．Reducing Glycosphingolipid Content in Adipose Tissue of Obese Mice Restores Insulin Sensitivity，Adipogenesis and Reduces Inflammation［J］．PLOS ONE，2009，4(3):4723．

［7］ 赵强，冯伟．针灸治疗单纯性肥胖取穴规律的临床研究［J］．天津中医药大学学报，2011，30(2):95－97．

［8］ 蔡辉，袁爱红，魏群利，等．针刺对2型糖尿病大鼠肝组织IRS1 和2 基因表达的调整［J］．中华中医药学刊，2009，27(6):1140－1142．

［9］ 何军锋，严洁，刘健华，等．胃扩张和针刺大鼠四白传入信息对孤束核神经元放电整合的影响［J］．中华神经医学杂志，2005，4(4):330－333．

［10］ He Junfeng，Yan Jie，Chang Xiaorong，et al．Neurons in the NTS of rat response to gastric distention stimulation and acupuncture at body surface points［J］．The American Journal of Chinese Medicine，2006，34(3):427－433．

［11］ 叶爱丽，陆付耳，徐丽君，等．黄连解毒汤对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌IRS－1 表达及酪氨酸磷酸化水平的影响［J］．中医杂志，2005，16(9):695－697．