苜蓿黄酮提取富集工艺的研究

孙海峰，贾秀娟

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

紫花苜蓿(Medicago sativa L．)简称苜蓿，为1年生或多年生的草本植物，属豆科草类，国内外均有分布，是草原地带栗钙土和暗栗钙土的典型植物［1］。《本草纲目》谓其能“安中利人，可久食。利五脏，轻身健体，洗去脾胃间邪热之气，通小肠诸恶热毒”［2］。苜蓿黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，具有多种生物活性。在抗衰老、抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤、护肝、抑制高血压、高血脂、调节内分泌系统、增强机体免疫力、预防心血管疾病及止痛镇痛等方面都具有良好的作用［4－6］。随着人们医疗保健意识的增强，具有多功能的苜蓿黄酮有广阔应用前景，但目前苜蓿黄酮提取工艺落后，因此，本研究采用均匀设计法安排实验，优化苜蓿总黄酮提取富集工艺，为苜蓿黄酮开发利用奠定基础。

1 仪器与试剂

1．1 仪器

SP－722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);FA1004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);恒温水浴箱(江苏金坛市医疗仪器厂);植物微型粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);K－Q500E型医用超声清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司)。

1．2 试剂

芦丁对照品(成都思科华生物技术有限公司，纯度98%);亚硝酸钠(分析纯，天津市化学试剂六厂三分厂);硝酸铝(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);氢氧化钠(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司);95%乙醇(分析纯，北京化工厂);AB－8，HPD－600，D101 大孔树脂(南开大学化工厂)。

2 方法与结果

2．1 黄酮的含量测定

2．1．1 最大吸收波长的确定

对照品溶液与供试品溶液在200～700nm处进行扫描，发现在265nm或357nm附近有最大吸收峰，且357nm最稳定可靠，因此实验中选择该波长。

2．1．2 标准曲线制备

取芦丁对照品溶液 0、1、2、3、4、5ml，分别置 10ml容量瓶中，加 5%亚硝酸钠溶液 0．3ml，摇匀，放置6min，加 10%硝酸铝溶液 0．3ml，摇匀，放置 6min，加1mol/l氢氧化钠4．0ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15min后于选定的测定波长处测吸光度，以浓度C为纵坐标，吸光度值A为横坐标进行线性回归，得方程。标准曲线 Y=12．997X－0．0054，R=0．9997。

2．1．3 供试品溶液的制备

取苜蓿10g，精密称量，置圆底烧瓶中，加入乙醇120ml，回流提取1h，共2次，过滤，冷却后取部分溶液离心5min，取药液0.5ml置10mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度。

2．1．4 精密度实验

取芦丁对照品溶液(0．1mg/ml)适量，连续测定6次，RSD为=0．47%，表明精密度良好。

2．1．5 稳定性实验

取供试品溶液，分别于 0、10、30、60、90、120min 测定，RSD为1．00%，表明稳定性良好。

2．1．6 重复性实验

分别取同一批次的苜蓿提取物，平行取样6份，制成供试品溶液，依法测定，RSD为1．04%，表明重现性好。

2．1．7 加样回收实验

精密称取已知含量的药材粉末6份，每份约50mg分别加入一定的芦丁对照品溶液，按供试品溶液制备项下操作制备样品溶液，与510nm处测定吸收率，计算回收率为98．91%，RSD为1．74%。

2．2 提取方法的考察

称取10g苜蓿粉末3份，加入120ml 70%的乙醇，分别用加热回流萃取、冷浸提取、超声萃取的方法提取2次，每次1h，冷却后取部分溶液离心5min，再取0.5ml稀释到10ml测吸光度，回流提取制备液吸光度值最大，结果表明，回流提取方法最好。

2．3 提取工艺的优化

采用均匀设计法，按U6(63)选用固液比(A)，乙醇浓度(B)，提取时间(C)三个因素，每个因素6个水平，共进行6个处理，每个处理重复3次，每份10g。从节省原料的角度考虑选择70%的乙醇。见表1、表2。

表1 提取因素水平表

表2 均匀实验结果 (n=3)

经多元回归分析得回归方程:Y=37．0523－0.9449X1+0．0030X2×X2－0．0072X1×X2+0．0592X1×X3。

经检验，复相关系数 R=0．9998;F=4000．9，F＞F0．1(4．1)，表明方程显著，黄酮提取率和各因素间有很好的线性关系。对方程进行优化求极大值，在检验精度 α=0．05 条件下，得出优化参数 X1=71．0、X2=128．1、X3=19。即醇浓度 71%料液质量比为1∶19，提取时间128min，此时提取率预测值为34．2mg/g。经实验测定能达到这个预测值，表明所优化的条件为最优水平。

2．4 大孔吸附树脂富集工艺条件优化

2．4．1 上样方法考察

分别采用干法和湿法上样，树脂选用D101，干法上样取大孔树脂20g，精密称70%乙醇提取物1．0g，拌入10g树脂中，挥干溶剂，干法加样于装好的树脂柱中，依次用6BV蒸馏水，10BV 95%乙醇洗脱，控制流速为1ml/min，收集水和乙醇洗脱液，回收溶剂至干。湿法上样取预处理好的D101 大孔树脂30g，装柱待用。精密称取醇提物1g，用10mL蒸馏水超声加热溶解，加样于装好的树脂柱中，饱和24h，其它条件同干法上样。测定大孔树脂D101对总黄酮的比吸附率和解吸率。结果见表3。

表3 上样方法的考察

结果表明干法上样优于湿法上样。

2．4．2 树脂型号考察

取处理好的 AB－8(弱极性)，D101(非极性)，HPD(极性)三种型号大孔树脂各20g，采用2．4．1 干法上样法，测定总黄酮含量，计算树脂的比吸附率和解吸率。结果见表4。

表4 树脂型号考察结果

结果表明，D101 树脂比吸附率(18．6mg/g)和解吸率(74．6%)较高，因而选择D101 树脂。

2．4．3 最佳拌样比

将预处理好的大孔树脂各15g装于四根径高比一致的柱子中待用，按树脂(g):生药量(g)为1∶0．4，1∶0．7，1∶1，1∶1．5 的比例依次称取 4 份，采用 2．4．1干法上样法，测定各组有效成分的含量。结果见表5。

表5 最佳拌样比结果

结果表明，最佳拌样比1∶1 时总黄酮泄漏量较小，效果好。

2．4．4 上样量考察

取预处理好的树脂10g，15g，20g，25g分别装于四根径高比一致的柱子中，采用2．4．1 干法上样法，测定总黄酮泄漏量和总黄酮泄漏百分率。结果见表6。

表6 上样量考察结果

上样量考察结果表明，1∶20 时总黄酮泄漏量小，效果较佳。

2．4．5 水洗脱体积考察

取预处理好的D101 大孔树脂20g装柱待用，采用2．4．1 干法上样法，用蒸馏水洗脱，每BV(30ml)为一个考察单位，控制流速为1ml/min，各自收集洗脱液，检测有效成分泄漏量。结果见表7。

表7 水洗脱体积考察

结果表明，在节约资源的前提下，2倍水洗脱体积泄漏量较低，总黄酮含量最高，因此，选择2倍水体积。

2．4．6 乙醇洗脱浓度的考察

精密称取提取物1．0g，采用2．4．1 干法上样法，分别用30%，50%70%，95%的乙醇洗脱，测定所得干膏中黄酮含量，有效成分解析率。结果见表8。

表8 乙醇洗脱浓度考察结果

结果表明，70%乙醇洗脱总黄酮含量、解析率最高，因此，70%乙醇洗脱效果最佳。

2．4．7 乙醇洗脱体积的考察

取处理好的大孔吸附树脂，采用2．4．1 干法上样法，用70%乙醇洗脱，每1BV为一个考察单位，收集4份，回收溶剂至干，称重，测定干膏中总黄酮的含量和总黄酮累计转移率。结果见表9。

表9 乙醇洗脱体积考查

结果表明，本着节约原则3倍乙醇洗脱总黄酮含量累积较高，转移率68．6%，因此，3倍乙醇洗脱体积最优。

2．4．8 洗脱流速考察

取处理好的大孔吸附树脂20g 4份，分别装于相同规格的四根柱中，采用2．4．1 干法上样法，分别用3BV 的水洗脱，然后分别以 1、2、3、4 ml/min流速，用70%乙醇洗脱，测定得到干膏中总黄酮的含量，计算总黄酮转移率，分别为 82．4%、84．6%、79．7%、71.0%。结果表明，总黄酮转移率在流速控制在2ml/min，由洗脱流速和树脂柱截面积的关系得出，洗脱流速为0.325ml/cm2/min总黄酮转移率最高。

3 讨论

目前，对苜蓿黄酮的提取有冷浸提取、微波提取和超声提取法，但提取率不高。如张咏梅［6］的微波提取苜蓿黄酮的最佳工艺为:40%乙醇浓度，1∶30 固液比，微波500w功率下作用60s;在此工艺条件下，黄酮提取量的理论值为 4．92mg/g，接近于实际测定值4.88mg/g。朱宇［7］的苜蓿黄酮最佳提取条件为乙醇浓度60%，料液比1∶35，提取温度50℃，提取时间1.5h，在此最佳条件下苜蓿异黄酮的提取率为17.12mg/g。本实验的提取率高于前人的结果，提取率预测值为34．21mg/g。进一步对大孔树脂富集工艺进行优化，对于紫花苜蓿总黄酮以D101 树脂效果较好，得最佳富集工艺为，拌样比1∶1，上样量1∶20，2倍水体积洗脱洗涤，70%醇洗脱，3倍乙醇洗脱体积，流速控制在2ml/min。在此条件下得到的紫花苜蓿总黄酮收率为4.9%，富集物总黄酮含量为51%，有效成分转移率86．5%，对紫花苜蓿总黄酮的开发利用奠定基础。

正交设计法在黄酮类化合物在提取纯化优化的实验研究中采用的较多，该种方法相对完全实验减少了实验次数，使实验条件得到优化，但是该方法的优化结果是从实验设计有限的因素水平中得到的结果，由于水平少，不能得到最佳水平。然而均匀设计法弥补了这一不足，通过增加水平数，建立线性回归方程求极值，计算出最佳水平，本实验在均匀设计的条件下得到的数据结果科学合理。

［1］ 王勇，刘学义．我国苜蓿研究现状、存在问题及对策［J］．内蒙古农业科技，2004(6):6－7．

［2］ 高微微，何春年，佟建明．我国苜蓿属植物资源及应用概况［J］．时珍国医国药，2006，17(5):680－681．

［3］ 胡明，卢德勋，牛文艺，等．苜蓿皂甙及其生物活性［J］．中国畜牧兽医，2007，34(1):9－12．

［4］ 何春年，李展，高微微，等．紫花苜蓿化学成分的研究［J］．天然产物研究与开发，2008，20(6):1005－1011．

［5］ 何云，刘圈炜，王成章．紫花苜蓿活性成分研究进展［J］．饲料工业，2005，26(17):52．

［6］ 张咏梅，晏石娟，曹致中，等．微波辅助提取苜蓿黄酮方法的研究［J］．草地学报，2008，16(1):76－80．

［7］ 朱宇旌，李新华，张勇，等．花苜蓿中总异黄酮提取研究［J］．沈阳农业大学学报，2007，38(6):856－859．