腹腔灌注冲洗疗法对游离胃癌细胞腹腔转移的预防作用

李胜云，白 冰，徐振亚

郑州大学第一附属医院医院感染管理科郑州450052

△女，1967年9月生，硕士，副教授，研究方向:腹腔肿瘤术中腹腔灌注冲洗疗法的应用，E-mail:lishengyun1@163.com

腹腔转移是胃癌根治术后最常见的复发方式，也是胃癌患者最常见的死因［1］。术前、术中或术后来自肿瘤浆膜层或淋巴结上肿瘤细胞的脱落被认为是微转移发生的主要条件［2］。腹腔灌洗疗法是腹部外科常用的诊疗技术之一，广泛应用于各种腹腔恶性肿瘤术中，因目前国内缺乏统一的较为成熟的标准，所以在临床操作中较随意。为此，作者探讨持续腹腔灌洗对不同分期胃癌患者肿瘤切除后腹腔内游离胃癌细胞残留量的影响，为临床操作提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 检测对象 选择2010年1月至2012年1月在郑州大学第一附属医院行胃癌切除术且病理证实为腺癌的72例患者为研究对象，参照2011年NCCN 胃癌指南将72例患者按不同胃癌分期分为7组(表1)，分别进行术中腹腔灌洗。该研究经郑州大学伦理委员会审批通过并征得患者及家属签字同意。

表1 患者一般情况

1.2 腹腔灌洗及标本采集 在胃癌切除及完成消化道重建后，立即给予37℃生理盐水500 mL 灌洗，轻搅动后，经吸引器将灌洗液抽入负压鼓中。每次灌洗后均更换负压鼓，取负压鼓中的灌洗液送检，每位患者灌洗6 次，记录灌洗液中胃癌细胞数量为0时的灌洗次数，分析同分期患者灌洗液中检测不到胃癌细胞时的最高灌洗次数。

1.3 腹腔灌洗液的流式细胞仪检测 收集每次腹腔灌洗液，2 000 r/min 离心10 min，弃上清，保留沉淀。将沉淀用PBS 稀释，制成混悬液，取80 μL，加入CD45(BD 公司，货号为347464)5 μL 和CEA/CD66(eBioscience 公司，货号为17-0668)5 μL 混匀，静置20 min，加溶血素1 mL，混匀，静置10 min，1 300 r/min 离心5 min，弃上清，加入PBS 2 mL，再以1 300 r/min 离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS混匀，上流式细胞仪(BD 公司)。以CEA 和CD45为检测指标，以细胞数为30 万设门，通过流式细胞仪检测灌洗液中CD45 阴性且CEA/CD66 阳性的细胞［CEA(+)CD45(－)］表达情况，计算CEA(+)CD45(－)细胞的百分比。然后，另取100 μL 混悬液滴于载玻片上，在显微镜下计细胞数，从而推算出腹腔灌洗液中总细胞数，乘以细胞阳性率，得出腹腔灌洗液中胃癌细胞总数。每次检测均重复3 次。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0 进行分析，应用重复测量数据的方差分析比较组别效应和时间效应的差异，采用Bonferroni 法进行组间两两比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 胃癌分期和灌洗次数对灌洗液中胃癌细胞数量的影响 见表2。

表2 胃癌分期和灌洗次数对灌洗液中胃癌细胞数量的影响 个

2.2 最高灌洗次数 见表3。因为ⅢB、ⅢC 及Ⅳ组患者灌洗至第6 次时仍可检测出胃癌细胞，故不作分析。

表3 不同胃癌分期患者灌洗液中胃癌细胞数为零时的灌洗次数 灌洗次数

3 讨论

目前腹腔内持续温热灌注化疗(continuous hyperthermic peritoneal perfusion，CHPP)［3-4］被认为是安全可靠的治疗方案［5］，其理论依据在于温热化疗不仅可改变癌细胞的通透性，使化疗药物能有效地渗入癌细胞内，充分发挥其抗癌作用，还能抑制化疗后肿瘤细胞的修复，增加肿瘤细胞对抗癌药的敏感性［6］。该研究改变了CHPP 在密闭通道中循环灌洗的方式，采用生理盐水多次大剂量灌洗腹腔，易于在术中操作，此外，作者认为与CHPP 相比，大剂量腹腔灌洗可将脱落于腹腔的肿瘤细胞块直接吸出体外，还避免化疗药物及热效应杀伤正常组织细胞。

该研究按照NCCN 指南分期将患者分为7组，结果显示，胃癌分期效应差异有统计学意义，随分期进展，胃癌细胞呈增加趋势，特别是Ⅳ期患者与其余各组的两两比较差异均有统计学意义。这一结果与胃癌分期及胃癌腹腔转移的途径相符。有研究［7］表明，肿瘤细胞除了直接从肿瘤组织上脱落至腹腔外，侵及浆膜层的肿瘤细胞可以穿透及逸出至腹腔，淋巴通道的开放也可使有活性的肿瘤细胞播散到腹腔，这些播散方式均可使不同分期胃癌患者的腹腔中游离癌细胞数量存在差异。

该研究结果亦显示，随灌洗次数的增多，胃癌细胞呈现递减趋势，这与Marutsuka 等［8］的结果一致:研究者对63例未侵犯浆膜的进展期胃癌患者使用术中灌洗的方法，发现连续6 到8 次用1 L 生理盐水灌洗腹腔，可使游离癌细胞数由(3.8±1.4)×106L－1降为(28±15)L－1，7 到9 次灌洗后腹腔内无游离癌细胞。但对于Ⅰ期患者冲洗1 次，ⅡA 期患者冲洗3 次已基本无游离癌细胞，这可能与Ⅰ期、ⅡA 期早期胃癌未侵及淋巴结，术中脱落细胞少等原因有关。该研究还对胃癌细胞为0 时所需的灌洗次数进行统计描述，ⅡA 期患者需灌洗3 次，ⅡA 期以上患者术中需灌洗至少6 次。

细胞学检查和实时定量RT-PCR 是诊断胃癌腹腔内播散的常用方法，然而前者敏感率(14%～70%)较低［9］，而后者尚未发现一种特异的基因片段来诊断胃癌细胞。CEA 癌胚抗原是消化系统癌变的辅助诊断指标，目前多以CEA 作为目的基因检查腹腔灌洗液，但血细胞、腹腔的间皮细胞及手术操作导致脱落的胃肠道上皮细胞均有可能表达CEA［10］，PCR 又是敏感性很高的检查，出现假阳性的概率高，指标的选取和操作的严谨性都严重影响着结果的准确性。该研究以CEA 和CD45 为检测指标，应用流式细胞仪检测腹腔灌洗液，同时具备了高敏感性和高特异性，是理想的检查手段。流式细胞术检测CEA 在胃癌组织中的阳性表达率为86.0%［11］。CD45 是人白细胞共同抗原，对原始/幼稚细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、有核红细胞及细胞碎片均有不同程度表达［12］。通过加入CD45-percp，尽可能排除其他细胞的干扰，故CEA(+)CD45(－)细胞可被认为是胃癌细胞。

总之，该研究结果显示持续腹腔灌洗可有效减少腹腔内游离癌细胞，ⅡA 期及以上的胃癌患者切除肿瘤后进行术中腹腔灌洗，对预防游离癌细胞腹腔转移有确切疗效，且符合无伤害原则，操作简便且安全，医疗成本较低，不良反应少，易于推广。该文重点汇报了冲洗次数对不同分期胃癌患者腹腔游离癌细胞数量的影响，课题的后续研究将继续从冲洗液温度、冲洗量、冲洗时机等不同角度开展临床实验，以期得到客观有据的腹腔灌注冲洗方案，便于临床应用。

［1］Kodera Y.Disseminated cancer cells in the peritoneal cavity:what can we do when we detect them?［J］.Gastric Cancer，2008，11(4):192

［2］Kodera Y，Yamamura Y，Shimuzu Y，et al.Peritoneal washing cytology:prognostic value of positive findings in patients with gastric carcinoma undergoing a potentially curative resection［J］.J Surg Oncol，1999，72(2):60

［3］Facchiano E，Scaringi S，Kianmanesh R，et al.Laparoscopic hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC)for the treatment of malignant ascites secondary to unresectable peritoneal carcinomatosis from advanced gastric cancer［J］.Eur J Surg Oncol，2008，34(2):154

［4］应敏刚，陈路川，严俊，等.胃癌术后早期腹腔持续温热灌注化疗的安全性研究［J］.癌症进展，2004，2(2):102

［5］巴明臣，崔书中，唐云强，等.腹腔热灌注化疗对患者生命体征的影响［J］.中国普通外科杂志，2010，19(4):450

［6］Bando E，Yonemura Y，Takeshita Y，et al.Intraoperative lavage for cytological examination in 1297 patients with gastric carcinoma［J］.Am J Surg，1999，178(3):256

［7］应敏刚，陈路川，陈夏，等.胃癌术后早期腹腔持续温热灌注化疗的临床意义［J］.中国临床医学，2005，12(1):88

［8］Marutsuka T，Shimada S，Shiomori K，et al.Mechanisms of peritoneal metastasis after operation for non-serosa-invasive gastric carcinoma:an ultrarapid detection system for intraperitoneal free cancer cells and a prophylactic strategy for peritoneal metastasis［J］.Clin Cancer Res，2003，9(2):678

［9］秦贤举，陈德杰，吴军，等.胃癌患者术中腹腔灌洗细胞学检测的临床研究［J］.肿瘤防治研究，2003，30(5):406

［10］景晓刚，王贵吉，裴迎新，等.胃癌患者血脂、脂蛋白、血清CEA 及CA199 检测［J］.郑州大学学报:医学版，2011，46(3):432

［11］刘宏斌，赵宏伟，韩晓鹏，等.腹腔冲洗液检测CEA 预测胃癌腹腔种植转移的临床意义［J］.中国普通外科杂志，2009，18(10):1005

［12］张玮，程小丽，杨玉琮，等.流式细胞术CD45/SSC 设门在急性白血病免疫分型中的应用［J］.西安交通大学学报:医学版，2007，28(4):462