双歧杆菌黏附素对应激大鼠肠黏膜炎性反应的影响

江 涛，徐 涵，康 凯，柳先丽，舒晓亮，谢良民

(1.广西中医大学第一附属医院营养科，广西南宁 530023;2.同济大学附属东方医院营养科，上海 200120)

肠道微生态改变可引起肠黏膜炎性反应，肠黏膜炎性反应后进一步损伤肠黏膜，而细菌和内毒素易通过损伤的肠黏膜抵达黏膜下层，进一步加剧炎症反应，严重可诱发多器官功能障碍［1］。双歧杆菌是人体肠道中最重要的益生菌，对维持肠道微生态平衡和肠黏膜屏障功能具有重要作用，双歧杆菌黏附素由多结构和功能的蛋白质、短肽、糖蛋白、糖脂和多糖分子构成，这些分子分布在双歧杆菌的细胞壁、鞭毛、荚膜和小丝状体，黏附素不但可以介导母菌对靶细胞的黏着，激发黏附的细胞信号转导，而且可以通过与致病菌竞争肠道黏膜表面特定的结合位点，抑制致病菌与肠道黏膜的结合。应激反应时双歧杆菌有可能通过黏附素的作用，减轻肠黏膜炎性反应和损伤，本研究目的在于探讨应激条件下，双歧杆菌黏附素对肠黏膜炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 动物应激模型

健康雄性 Sprague-Dawley大鼠48只，平均体质量为(155±17)g，经适应性喂养3 d后随机分为应激组和应激+黏附素组，每组24只，将应激组和应激+黏附素组大鼠置于3～6 cm半径的铁质圆桶状小舱内，单笼饲养，限制活动，每天接受6 h束缚应激，持续21 d，造成大鼠应激模型。

1.2 实验动物分组

将应激模型大鼠按随机数分组法分为应激组和应激+黏附素组进入实验期，每组24只，大鼠在洁净的动物室，不锈钢笼单只饲养，应激+黏附素组大鼠进食能全素(纽迪希亚公司)+黏附素5 mg/kg灌胃，应激组大鼠进食能全素+5 mg/kg生理盐水，两组大鼠每日给予相同热量、氮量热量(125.4 kJ/kg，氮量0.2 g/kg)的肠内营养(能全素，纽迪希亚公司)供给，每只大鼠需要的肠内营养一次性放入单个不锈钢杯(不锈钢笼配带)供自由进食，黏附素和等量生理盐水在给大鼠喂饲肠内营养前一次性灌胃，记录进食量和体质量变化，在造模前(正常参数)、造模后(造成应激模型后)、实验第3天和实验第8天，分别选取6只大鼠在麻醉下，股动脉采血5 ml在 3 000 r/min，下离心 10 min，取血清，置于－80℃冰箱冷冻保存待测，取出小肠末端距回盲部10 cm的小肠组织用于病理分析和肠黏膜炎性因子含量的检测。

1.3 双歧杆菌黏附素的提取及纯化

将青春型双歧杆菌1 027株接种于硫乙醇酸盐液体培养基，置厌氧培养箱37℃培养48 h，在液体培养条件下，双歧杆菌的黏附素是一种分泌性蛋白质，分布于细菌耗尽培养液的上清部分，离心收集培养液上清部分，经300 g/L硫酸铵沉淀，在4℃下8 000 r/min离心 30 min收集沉淀物，沉淀经Superdex75柱凝胶过滤和Q-SepharoseFF离子交换色谱纯化，收集第一峰，其相对分子质量为16 000 Da，冻干保存备用。

1.4 检测指标

检测两组大鼠造模前、造模后、实验第3天和第8 天血浆IL-6、IL-10、TNF-α 和IFN-γ 水平。用酶联免疫吸附法检测 IL-6、IL-10、TNF-α 和 IFN-γ(ELISA 试剂盒，RnD Ltd.USA)。

肠黏膜 IL-6、IL-10、TNF-α 和 IFN-γ 含量测定。取空肠近端2 cm小肠，用生理盐水冲洗，用手术刀刮取200～300 mg的肠黏膜制成匀浆，将得到的组织匀浆与9倍体积的生理盐水稀释，然后在800×g下离心分离10 min得到上清液，检测组织匀浆上清液中的 IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ(ELISA 试剂盒，RnD Ltd.USA)含量，结果表示为pg/g湿重。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 肠黏膜和血浆IL-6和IL-10水平的变化

与造模前比较，造模后应激组和应激+黏附素组肠黏膜和大鼠血浆IL-6水平明显升高(P=0.002)，而 IL-10 差异无统计学意义(P=0.073，0.085);实验第3天和第8天，应激组大鼠肠黏膜和血浆IL-6水平明显高于造模前(P=0.001)，血浆IL-10水平差异无统计学意义(P＞0.05)，而应激+黏附素组大鼠肠黏膜和血浆IL-6和IL-10水平与造模前相比差异无统计学意义(P＞0.05)。与造模后和应激组比较，实验第3天和第8天，应激+黏附素组大鼠肠黏膜和血浆IL-6水平明显降低(P＜0.05)，而 IL-10水平明显升高(P＜0.05)，而应激组IL-6和IL-10浓度差异与造模后比较，无统计学意义(P ＞0.05)，见表1、2。

表1 大鼠血浆炎性因子水平变化Tab.1 Comparison of inflammation factor levels in rat blood and intestinal mucosal between two groups(n=24)

2.2 肠黏膜和血浆TNF-α和IFN-γ水平的变化

与造模前比较，造模后应激组和应激+黏附素组肠黏膜和大鼠血浆TNF-α和IFN-γ浓度明显升高(P均 =0.000)，而 IL-10差异无统计学意义(P=0.064，0.093);实验第 3 天和第 8 天，应激组大鼠肠黏膜和血浆IFN-γ和TNF-α浓度明显高于造模前(P均=0.000)，而应激 +黏附素组大鼠肠黏膜和血浆TNF-α和IFN-γ水平与造模前相比差异无统计学意义(P均 ＞0.05)。与造模后和应激组比较，实验第3天和第8天，应激+黏附素组大鼠肠黏膜和血浆 TNF-α和IFN-γ水平明显降低(P 均＜0.05)，而应激组TNF-α和IFN-γ浓度差异与造模后比较无统计学意义(P 均 ＞0.05)，见表 2。

3 讨 论

肠黏膜在保护机体免受食物抗原、微生物的损害、维持内环境稳定起着重要作用［2］。应激条件下肠黏膜受损，肠源性炎性介质和细胞因子释放增加，严重时可引起炎症反应综合征［4］。IL-6、TNF-α、IFN-γ 是一组由单核巨噬细胞、内皮细胞产生的细胞因子，这些细胞因子在肠黏膜应激后大量释放，并随血流在局部或作用于远端组织，进一步加剧炎性反应和肠黏膜损伤［3］。研究表明，双歧杆菌对受损的肠黏膜有修复的作用，可降低 TNF-α 和 IFN-γ在肠黏膜的分泌［4］。本实验结果显示，应激组大鼠肠黏膜和血浆IL-6、TNF-α和IFN-γ水平明显高于造模前，而应激+黏附素组肠黏膜和血浆 IL-6、TNF-α和 IFN-γ水平明显低于造模后和应激组，提示应激导致肠黏膜和血液炎性反应明显加剧，给予双歧杆菌黏附素炎症反应明显缓解，这可能是黏附素抑制了细胞因子的表达及其介导的炎性反应。IL-10是具有抗炎症反应的白细胞介素，通过抑制T细胞经肠道微生物刺激分泌的促炎症反应物质如IL-6、TNF-α 和 IFN-γ［5］。双歧杆菌还可刺激肠道细胞产生IL-10，实现免疫调节［6］，本实验结果显示应激+黏附素组IL-10水平高于应激组和造模后，表明黏附素通过刺激大鼠IL-10的合成或分泌，从而下调炎性反应。本实验中肠黏膜和血浆IL-6、TNF-α、IL-10水平升高或降低是相似的，表明应激状态的大鼠，肠黏膜和血液的炎性反应水平具有一致性。

应激条件下，双歧杆菌黏附素可调节炎性介质和细胞因子的释放，减轻炎症反应，修复损伤的肠黏膜，对肠黏膜具有保护功能。

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