胆固醇、pH值对金属离子与磷脂酰甘油相互作用成膜的影响

张 桥，刘志存，张灵芝，赵 锐，牛蓉芬，刘春艳

(陕西师范大学物理学与信息技术学院，西安 710062)

目前，制备优质的LB膜正日益受到关注。利用各种方法对LB膜进行相行为与分子组装的研究对生命过程分析具有重大意义［1］。迄今为止人们对单因素对LB膜的影响的研究已经比较成熟，而研究多因素同时对LB膜的影响还比较少。本文主要研究多因素同时对LB膜的影响。该研究具有广泛的应用价值，有助于制备更高性能的单分子膜，进而有益于阐明生命过程中能量、物质、信息的传递机理［2］。

在LB膜实验中需要考虑3个或者3个以上的因素对其的影响，因此本研究采用正交实验。正交实验不但可以同时安排很多因素进行实验，而且可以同时寻求最优水平的组合。

1 材料与方法

1.1 仪器分析

LB膜分析仪器是由芬兰KSV公司生产，型号为Minitrough，分辨率为4 μN/m，膜天平测量范围为0～150 mN/m，水槽尺寸为364 mm×75 mm×5 mm，滑块压缩速度范围为0.01～400 mm/min，亚相体积为0.16 L，中心深度为70 mm。

1.2 材料

试剂:两亲分子材料——磷脂酰甘油(phosphatidylglycerols，PG)，它有2个非极性的尾部。本实验材料的两亲分子的极性头基带有一个单位的负电荷。胆固醇(cholesterol，Chol)，又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物。本次实验所使用PG购于美国Sigma-Aldrich公司，胆固醇购买于上海试剂公司。化学试剂包括无水乙醇、甲醇、氯仿、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)，全是国产分析纯。水为离子交换二次蒸馏水，pH值为6.8。

1.3 实验方法

将磷脂酰甘油材料溶于氯仿与甲醇体积比为49∶1的有机溶剂中，胆固醇材料溶于氯仿与甲醇体积比为3∶1混合的有机溶剂中，均制成0.5 mmol/L的溶液。在制备LB膜时，将浴槽温度控制在24±0.1℃范围之内。首先将配制好的PG溶液用50 μL微量注射器均匀地滴加在亚相液面之上，其次让其静置15 min，目的是为了让分子自动铺展，氯仿与甲醇彻底挥发。最后让LB膜仪器上的2个挡板以10 mm/min速度运动，这时计算机将开始自动记录π-A曲线数据［3-4］。π-A曲线是指:连续改变不同的条件得到PG单分子所占的单分子面积，此时膜压π(mN/M)与PG单分子所占面积A的之间的变化关系。表1为pH值、成膜物质的量、亚相及加入胆固醇量的实验设计数据。

表1 实验设计数据

2 实验结果

2.1 Chol对金属离子磷脂酰甘油单分子的影响

图1与图2是亚相分别为金属离子(KCl、MgCl2)，加入 PG 与 Chol(mol/mol)之比为:1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.7 所扫描的 π -A 曲线。从胆固醇对金属离子磷脂酰甘油单分子膜的π-A曲线中明显可以看出:随着加入胆固醇量的增加，气相部分明显减短，崩塌压压明显降低，相变点变化比较凸出，曲线也相对依次外扩，说明胆固醇有加速相变，促进金属离子磷脂酰甘油单分子膜稳定结构的形成［5］。

图1 亚相为Kcl溶液，PG与Chol摩尔之比为1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.7 的 π -A 曲线

图2 亚相为MgCl2溶液，PG与Chol摩尔之比为1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.7 的 π -A 曲线

2.2 pH值对金属离子单分子膜成膜的影响

图3和图4分别是不同pH值所得到的π-A曲线。当亚相是金属离子，pH值为酸性时，随pH值不断升高，相变点依次逐渐变凸。到pH值为6.8时，曲线相变点最为明显，崩塌压达到最大值。但是当pH值偏碱性，如在pH值为9.4时，磷脂分子更加紧密，形成较低能量的晶格结构，减小了重组的驱动力，磷脂分子相变有所延迟［6-7］。可见在酸性或者碱性条件下都会对金属离子PG单分子膜有影响。

图3 亚相为KCl溶液，pH值为2.6;4.6;6.8;9.4时的π-A曲线

图4 亚相为MgCl2溶液，pH值为2.6;4.6;6.8;9.4时的π-A曲线

2.3 加入成膜物质的量对金属离子单分子膜的影响

图5、6是加不等PG得到的π-A曲线。明显可以看出:当亚相分别是KCl或MgCl2溶液时，金属离子与极性头基之间有静电相互作用，增强了膜之间的结合能力，使膜分子更加紧密的排列［8-9］。加入 PG 的量在 20、30 μL 时，曲线相对依次外扩，气相部分随着PG量的增多而逐渐减少;当加入PG的量为35 μL时，相变点非常凸出，崩塌压可达到48 mN/m;当向加入 PG的量为45 μL时，曲线的外扩依次增大，但崩塌压却降低。以上结果说明成膜物质的量对单分子的形成也是有影响的。

2.4 不同条件下得到分子π-A曲线

以 A(亚相为Water、KCl、MgCl2)，B(加入成膜物质的多少，C(亚相pH值的改变)和D(加入胆固醇的多少)为因素，设计出一个四因素三水平的正交实验［10］。图7～9是在不同条件下得到π-A曲线。由于篇幅有限，本文只给出了3幅图。下面利用正交方法来分析PG单分子膜的最佳成膜条件。

图5 亚相为KCl溶液，加PG为20、30、35、45 μL 时的 π -A 曲线

图6 亚相为MgCl2溶液，加PG为20、30、35、45 μL 时的 π -A 曲线

图7 亚相为MgCl2溶液，加PG为30 μL，Chol为10 μL，pH=9.4时的 π-A 曲线

图8 亚相为KCl溶液，加PG为35 μL，Chol为0 μL，pH=9.4时的 π -A曲线

图9 亚相为Water，加 PG 为35 μL，Chol为10 μL，pH=6.8时的 π-A 曲线

2.5 PG单分子面积的正交实验

表2为正交实验设计表。

表2 正交实验设计表

图10～11是根据其差分析方法绘制的结果。明显可以看出kA3＞kA1＞kA2，这样就可断定A3为A因素的最优水平。同理，可以根据计算并确定B1、C2、D3分别为B、C、D因素的最优水平。由此可以得到4个因素的最优水平组合为:A3B1C2D3。R越大，表示该因素的水平变化对试验指标的影响越大，因素越重要。由图12分析可见，RB＞RA＞RC＞RD，因素影响主次顺序为B-A-C-D。

图10 根据极差分析方法绘制的k1、k2、k3值

图11 根据极差分析方法绘制的R值

3 结束语

综上所述，胆固醇的量、pH值及成膜物质的多少对形成致密的单分子膜有密切的关系。本文不但分析了单因素对单分子膜的影响，同时也分析了多因素对单分子膜的影响，最后运用正交实验，得到最佳的PG单分子膜的条件是:亚相为MgCl2，加入成膜物质的量为30 μL，亚相的pH值为6.8，加入胆固醇的量为20 μL。此外，得到了PG单分子成膜质量因素的影响主次顺序为:PG量因素高度显著，亚相物质因素显著，亚相pH值因素不太显著，加Chol量因素最不显著，即B-A-C-D。这对于以后研究生物膜结构和功能有很大的意义及价值。

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［2］薛萍，欧阳健明，郑文杰.膜/水界面的配位化学［J］.广东工业大学学报，2002(2):64-67.

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［5］王娟，常怡光，孙润广.胆固醇与磷脂酰乙醇胺/磷脂酰胆碱混合膜的热力学特性及其单层膜形态的AFM观察［J］.化学学报，2012，70(5):599-601.

［6］郝长春，孙润广.物理因素对磷脂酰胆碱单分子层影响［J］.原子与分子物理学报，2007，24(5):928-936.

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［8］李旸，刘志存.金属离子与单分子膜间的静电相互作用研究［D］.西安:陕西师范大学，2011.

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