外源5－氨基乙酰丙酸(ALA)对菘蓝苗期生长及有效成分含量的影响

汪牧耘，李雨晴，朱毅斌，肖云华，唐晓清，王康才

(南京农业大学中药材研究所，江苏南京210095)

菘 蓝 (Isatis indigotica Linn.)为 十 字 花 科(Brassicaceae)药用植物，其干燥根为中药板蓝根，具有清热解毒、凉血消肿和利咽的功效;其干燥叶为中药大青叶，具有清热解毒、抗菌消炎和凉血消斑等功效［1］，均为临床上常用的大宗中药材。菘蓝体内所含的靛蓝和靛玉红等吲哚类生物碱是主要活性成分，其含量能在一定程度上反映菘蓝的品质。在生产实践中，为获得高产优质的板蓝根与大青叶药材，必须采取适当的栽培调控措施。目前研究者多采用逆境处理的方法控制菘蓝体内有效成分的含量。段飞等［2］认为:20 mmol·L－1ABA 和 250 mmol·L－1NaCl胁迫处理可提高菘蓝组培苗中靛玉红含量;唐晓清等［3－4］的研究结果表明:适度淹水处理能提高菘蓝根部活性成分含量，经杀青处理后大青叶中靛蓝和靛玉红含量总体上呈上升趋势。目前尚未见采用植物激素调控菘蓝中靛蓝和靛玉红含量的研究报道。

5－氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一种广泛存在于各类生物机体活细胞中的非蛋白氨基酸，是所有卟啉类叶绿素和血红素生物合成的关键前体［5］;是植物体内天然存在的、生命活动必需的、代谢活跃的生理活性物质，可通过生物途径合成，也可由人工化学合成;具有无毒副作用且易降解、无残留的特点，可作为植物的壮苗剂、杀虫剂、增色剂、绿化剂和落叶剂等使用。施用人工合成的ALA可提高作物的生理活性［6－7］和产量［8－9］。

鉴于此，作者研究了喷施不同浓度5－氨基乙酰丙酸(ALA)对菘蓝苗期生长及其体内靛蓝和靛玉红含量的影响，探讨适宜的外源ALA施用浓度和方法，以期为菘蓝的优质高产栽培提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菘蓝种子来源于安徽亳州，由南京农业大学园艺学院王康才教授鉴定。于2011年5月26日选择籽粒饱满、健壮、无损伤且大小均匀的种子播种于塑料盆(直径340 mm、高度280 mm)内，播种基质为按照质量比2∶1配制的园土(含质量分数8%左右的有机质)和蛭石混合基质;出苗后每盆留5株生长一致的幼苗，常规管理;待幼苗长至6～8叶期进行ALA处理，种植期间严禁使用农药。

LC－20AT型高效液相色谱仪、UV－VIS检测器SPD－20A和N2000型色谱工作站(日本岛津公司)。靛蓝对照品(批号110716－201111)和靛玉红对照品(批号110717－200606)均购自中国药品生物制品检定所;ALA由苏州益安生物科技有限公司提供;甲醇为色谱纯;水为超纯水;三氯甲烷为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 ALA处理 分别吸取质量浓度10 g·L－1ALA原液5.00、2.50、1.33 和 1.25 mL，用蒸馏水分别配制成终浓度为50.0、25.0、13.3 和 12.5 mg·L－1的 ALA处理液，以蒸馏水为对照(CK，0.0 mg·L－1ALA)。

于2011年7月底至8月中旬进行ALA处理。每处理9盆，分为3组，分别用相应质量浓度的ALA处理液处理1次、2次和3次，每次处理间隔10 d，每一浓度重复3次。于处理的当天傍晚喷施ALA处理液，每株均匀喷施10 mL，喷施前均加入体积分数0.01%吐温－20作展着剂。于第1次处理的10 d后采样进行相关指标分析，采样后同时进行第2次ALA处理，以此类推;每次均从各处理中采集15株单株供分析用，其中随机取10株用于单株鲜质量和干质量的测定。

1.2.2 单株质量测定 将菘蓝单株根与叶分开，采用AR1140型电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司，精度0.000 1 g)分别称取鲜质量后置于60℃烘箱中干燥至恒质量，冷却后称取干质量，计算平均鲜质量和干质量。

1.2.3 靛蓝和靛玉红含量测定 精密称取靛玉红和靛蓝对照品4.40和1.90 mg，分别用三氯甲烷溶解并定容至25 mL，即为靛玉红和靛蓝对照品溶液。分别精密吸取二者对照品溶液各 1、2、4、6、8、10 和 12 μL，参照文献［1］的方法进行HPLC分析。以色谱峰面积(X)为横坐标、对照品浓度(Y)为纵坐标对标准曲线进行拟合，得到二者的回归方程分别为Y靛蓝=(2 000×10－4)X靛蓝+(3×10－4)，r=0.999 6(n=3)，线性范围为5.0 ～ 15.0 μg;Y靛玉红=(2 000×10－4)X靛玉红－(10×10－4)，r=0.999 9(n=3)，线性范围为 0.4 ～20.0 μg。

菘蓝地上部分烘干至恒质量，粉碎并过60目筛;精密称取地上部分粉末0.5 g，加入100 mL三氯甲烷浸泡15 h，然后于80℃水浴中索氏回流提取10 h，提取液减压浓缩至近干;用三氯甲烷溶解并定容至50 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试样液。分别吸取各供试样液5 μL，参照对照品的色谱条件进行HPLC分析;以色谱峰面积并参照标准曲线计算样品中靛蓝和靛玉红含量。

1.3 数据处理

采用Excel和SPSS 12.0统计分析软件对实验数据进行计算和统计分析。

2 结果和分析

2.1 ALA处理对菘蓝生长的影响

2.1.1 对单株质量的影响 用不同质量浓度ALA喷施1至3次后菘蓝根和叶片的鲜质量和干质量见表1。由表1可见:喷施ALA对菘蓝根的生长具有一定的促进作用。用不同质量浓度ALA处理1次后菘蓝单株根干质量均高于对照，除25.0 mg·L－1ALA处理组外，其他处理组与对照有极显著差异(P＜0.01);而用不同质量浓度ALA处理2次或3次，菘蓝单株根干质量均极显著高于对照。用不同质量浓度ALA处理1次后菘蓝单株根鲜质量也均高于对照，差异达极显著水平;而用不同质量浓度ALA处理2次或3次，单株根鲜质量或低于对照或高于对照，其中用25.0 mg·L－1ALA处理2次，单株根鲜质量极显著高于对照;用13.3 和12.5 mg·L－1ALA 处理3 次，单株根鲜质量极显著高于对照。

表1 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)处理不同次数对菘蓝根和叶片鲜质量和干质量的影响(n=10)1)Table 1 Effect of 5-aminolevulinic acid(ALA)treating for different times on fresh and dry weights of root and leaf of Isatis indigotica Linn.(n=10)1)

喷施不同质量浓度ALA溶液对菘蓝叶的生长有不同作用。用不同质量浓度ALA处理3次，菘蓝单株叶片干质量和鲜质量均高于对照，差异达极显著水平(P＜0.01);而用不同质量浓度ALA处理1次或2次，叶片干质量和鲜质量或高于对照或低于对照，其中用12.5 mg·L－1ALA处理1次或2次，叶片干质量和鲜质量极显著高于对照(P＜0.01)。

由此可见，多次喷施低浓度ALA对菘蓝营养期生长尤其是叶片生长有促进作用。

2.1.2 对根冠比的影响 用不同质量浓度ALA喷施1至3次后菘蓝根冠比的变化见表2。结果表明:采用不同质量浓度ALA处理1次，菘蓝的根冠比均高于对照。除13.3 mg·L－1ALA处理组外，用不同质量浓度ALA处理2次后菘蓝的根冠比均高于对照，说明在菘蓝营养期的早、中期喷施ALA可以促进其地上部分的生长。用不同质量浓度ALA处理3次，菘蓝的根冠比均明显低于对照，说明随着喷施次数的增加菘蓝地上部分的生长快于地下部分。

表2 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)处理不同次数对菘蓝根冠比的影响(n=10)Table 2 Effect of 5-aminolevulinic acid(ALA)treating for different times on root-shoot ratio of Isatis indigotica Linn.(n=10)

2.2 ALA处理对菘蓝中靛蓝和靛玉红含量的影响

2.2.1 对靛蓝含量的影响 用不同质量浓度ALA喷施1至3次后菘蓝叶片中靛蓝含量的变化见表3。由表3可见:用不同质量浓度ALA处理不同次数后，叶片中靛蓝含量均高于对照。用不同质量浓度ALA处理1次后，靛蓝含量均显著高于对照(P＜0.05);其中，12.5 mg·L－1ALA 处理组的靛蓝含量最高，与其他处理组和对照间均有极显著差异(P＜0.01)。用不同质量浓度ALA处理2次后，叶片中靛蓝含量也均高于对照，差异达极显著水平(P＜0.01);其中，50.0和12.5 mg·L－1ALA处理组靛蓝含量较高。用不同质量浓度ALA处理3次后，叶片中靛蓝含量也均高于对照，差异达显著水平(P＜0.05);其中，12.5 mg·L－1ALA 处理组靛蓝含量最高，达到 22.51 μg·g－1。

表3 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)处理不同次数后菘蓝叶片中靛蓝含量的变化(±SD，n=3)1)Table 3 Change of indigo content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

表3 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)处理不同次数后菘蓝叶片中靛蓝含量的变化(±SD，n=3)1)Table 3 Change of indigo content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

1)同列中不同的小写字母和大写字母分别表示差异显著(P=0.05)和极显著(P=0.01)Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference(P=0.05)and the extremely significant difference(P=0.01)，respectively.

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由表3还可见:随处理次数的增多，菘蓝叶片中的靛蓝含量呈现逐渐增加的趋势，其中对照组靛蓝含量由 14.83 μg·g－1增加至 17.83 μg·g－1;随处理次数的增多，各处理组靛蓝含量的变化趋势与对照组基本一致。总体上看，用 12.5 和 13.3 mg·L－1ALA 处理后靛蓝含量较高，说明用较低浓度ALA处理2次或3次有利于菘蓝叶片中靛蓝的积累。

2.2.2 对靛玉红含量的影响 用不同质量浓度ALA喷施1至3次后菘蓝叶片中靛玉红含量的变化见表4。由表4可见:用不同质量浓度ALA处理1次，叶片中靛玉红含量均高于对照，其中，50.0、13.3 和 12.5 mg·L－1ALA处理组靛玉红含量极显著高于对照(P＜0.01)，以 12.5 mg·L－1ALA 处理组靛玉红含量最高，达17.29 μg·g－1。用不同质量浓度 ALA 处理 2 次，叶片中靛玉红含量均高于对照，且各处理组与对照有极显著(P＜0.01)或显著(P＜0.05)差异;其中，12.5 mg·L－1ALA处理组菘蓝叶片中的靛玉红含量最高，达84.14 μg·g－1。用不同质量浓度 ALA 处理 3 次，25和50 mg·L－1ALA处理组靛玉红含量均低于对照，而13.3 和12.5 mg·L－1ALA 处理组靛玉红含量均极显著高于对照(P＜0.01);其中，13.3 mg·L－1ALA 处理组靛玉红含量最高，达 99.48 μg·g－1。

由表4还可见:随菘蓝的生长(或处理次数的增加)，各处理组及对照组叶片中靛玉红含量的变化趋势有一定差异。其中，50.0、25.0 和 12.5 mg·L－1处理组以及对照组的靛玉红含量均呈现低—高—低的变化趋势，仅变化幅度有所不同;而 13.3 mg·L－1ALA处理组的靛玉红含量随处理次数的增加呈逐渐增加的趋势。另外，处理2次后各处理组和对照组的靛玉红含量均大幅度高于处理1次，差异甚至达到约5倍。说明用低浓度ALA多次处理有利于菘蓝叶片内靛玉红的积累。

表4 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)处理不同次数后菘蓝叶片中靛玉红含量的变化(±SD，n=3)1)Table 4 Change of indirubin content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

表4 用5－氨基乙酰丙酸(ALA)处理不同次数后菘蓝叶片中靛玉红含量的变化(±SD，n=3)1)Table 4 Change of indirubin content in leaf of Isatis indigotica Linn.treated by 5-aminolevulinic acid(ALA)for different times(±SD，n=3)1)

1)同列中不同的小写字母和大写字母分别表示差异显著(P=0.05)和极显著(P=0.01)Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference(P=0.05)and the extremely significant difference(P=0.01)，respectively.

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3 讨论和结论

作为一种促生长剂，ALA在农作物栽培生产中的应用备受关注。ALA能提高椰枣(Phoenix dactylifera Linn.)品种的产量，改善其果实的品质［10］;低浓度ALA能提高辣椒(Capsicum annuum Linn.)幼苗对冷胁迫的耐受力，促进其生长［11］;ALA能通过提高血红素蛋白质的活力有效保护大豆〔Glycine max(Linn.)Merr.〕植株因冷应激造成的破坏性影响［12］;而将 ALA用于药用植物的研究目前主要集中于种子萌发及其幼苗生理特性方面［13－14］。菘蓝作为中药材板蓝根和大青叶的基原植物，通过适宜的栽培措施对其生长及活性成分含量进行调控，是获得高产优质药材原料的前提;采取适当的栽培调控措施提高靛蓝与靛玉红的含量也有助于其药材质量的提高。在本研究中，喷施不同质量浓度ALA均能促进菘蓝根干物质的积累，其中较低质量浓度(12.5和13.3 mg·L－1)ALA 不但对其生长有明显促进作用，还能促进菘蓝地上部分干物质的积累，且随ALA处理次数增加，干物质积累量也逐渐增加。说明ALA可能是通过增强叶片光合作用促进光合产物积累，从而促使根部生长。Al-Qurashia等［10］也得出了类似的研究结果。

ALA处理对菘蓝叶片中靛蓝和靛玉红含量均有影响，其中，用较低质量浓度ALA进行处理能有效提高靛蓝和靛玉红的含量;但用较高质量浓度(25.0和50.0 mg·L－1)ALA处理3次则不利于靛玉红积累。靛玉红作为药材大青叶的质量控制指标，其含量不得低于0.02%［1］，在菘蓝苗期用ALA处理1次后靛玉红含量均低于此标准，但处理2次或3次后靛玉红含量均高于此标准。结合菘蓝生长状况，建议在生产中选用较低浓度ALA进行处理，处理次数以2次或3次为宜，可一定程度提高菘蓝的产量和质量。

目前ALA在药用植物栽培生产中的应用尚未见系统的研究报道。ALA处理对菘蓝叶片中靛蓝和靛玉红含量的影响有差异，其作用机制是否与靛蓝和靛玉红结构差异有关?尚需进一步研究探讨。

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