三神散对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及其机制研究

延边大学中医学院，吉林 延吉 133002

血管性痴呆(Vascular dementia，VD)是由于脑血管疾病导致的认知功能障碍临床综合征。VD是引起老年性痴呆的第二病因，其研究近年来备受关注。本研究主要采用双侧颈总动脉结扎法制成血管性痴呆大鼠模型，探索三神散对 VD大鼠在学习记忆功能的作用及其作用机制，为 VD的防治提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 三神散(远志、石菖蒲、龙骨)购自延吉市中医医院；喜得镇片(批准文号：国药准字H1010054，产品批号：050177)；乙酰胆碱酯酶试剂盒购自Sigma公司。

1.2 实验仪器 Morris水迷宫及其记录分析系统(淮北正华生物仪器设备有限公司研制)；台式低温离心机(日本SYNYO 公司)；冰冻切片机(德国)；HM-200型电子天平(日本)。

1.3 实验动物 SPF级大鼠，体重200～250g，雌雄各半，由延边大学实验动物中心提供。

1.4 动物模型制备及分组给药 采用大鼠双侧颈总动脉结扎法制作VD模型。具体方法如下：10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠背位固定，保证大鼠呼吸畅通。颈前部去毛，碘伏消毒后行颈正中切口l～2cm，钝性分离双侧颈总动脉后，用l号线将其永久性结扎。局部消毒后缝合颈部肌肉和皮肤，将大鼠置于保温台上，直至清醒。模型组和给药组行上述手术处理，假手术组仅分离而不结扎颈总动脉。造模后7周手术组动物随机分为模型组、喜得镇组、三神散低剂量组(10mg/kg)、三神散中剂量组(20mg/kg)和三神散高剂量组(30mg/kg)，共6组，每组7只。术后8周分别灌胃给予三个剂量的三神散，3次/周，连续给药4周；喜得镇组按0.6mg/kg灌服，假手术组、模型组灌胃等量生理盐水。

1.5 Morris水迷宫测试 灌胃结束前5天，开始进行Morris水迷宫测试。Morris水迷宫主要装置包括一个直径160cm，高60cm的黑色圆柱形水池及一套图像自动采集处理系统。池壁有4个入水点可将水池均分为4个象限。在目标象限中央放置一个直径10cm，高23cm的隐藏平台。水温维持在(22±1)℃，水面高于隐藏平台0.8cm，室温保持在(24±1)℃。实验期间水迷宫周围参照物不变。试验前一天，大鼠在水迷宫中自由游泳5min熟悉环境。定位航行实验：实验历时4d，每天分上午、下午两个时段分别测试，每只各测试2次。训练时将大鼠面向池壁从不同象限轻放入水中，同时记录其在120s内四肢爬上平台的时间，即上台潜伏期(APLP)。

1.6 超氧化物歧化(SOD)、丙二醛(MDA)、Ach含量测定 水迷宫测试结束后，动物麻醉后开胸，用真空采血管(预先涂有促凝剂)心脏取血，采血针从左心室进入取血后离心(3000rpm，10min)，取上清液。利用黄嘌呤氧化法与硫代巴比妥酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。断头处死大鼠，于冰台上取出脑组织，剔除小脑及脑干。冰生理盐水冲净表面血迹，滤纸拭干，电子天平称重。在冰盒内使用玻璃匀浆器制备10%的脑组织匀浆，4℃离心(4 000 r/min×10 min)，取上清进行实验，采用碱性羟胺法测定乙酰胆碱(Ach)含量。

2 结果

2.1 三神散对VD大鼠行为学的影响 定位航行试验中，模型组的逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.05)；与模型组相比，干预组、三神散高剂量组大鼠APLP明显缩短，差异有显著性意义(P<0.05)。

2.2 三神散对VD大鼠SOD、Ach含量及MDA活性的影响 与假手术组比较，模型组SOD、Ach含量明显降低，MDA含量明显升高，差异有显著性意义(P<0.05)；与模型组比较，喜得镇组、三神散高、中、低剂量组SOD、Ach含量明显升高(P<0.01)，MDA含量明显降低(P<0.01)。

表1 三神散对各组大鼠上台潜伏期的影响

表2 三神散对VD模型大鼠SOD活性、 MDA及Ach含量的影响

3 讨论

血管性痴呆病因较为复杂，但以缺血性脑血管疾病为最多见，现已证明[1-2]，脑缺血可引起脑组织损伤和功能障碍，影响最明显的部位是脑前区和海马纹状体区，其损伤机制与氧自由基损伤、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸的神经毒作用、血管活性物质的过度释放、脑内乙酰胆碱[3]含量降低等有关。大量研究表明，这些细胞内外信号的改变可从不同途径影响学习记忆相关的通路而引起功能障碍。Morris水迷宫实验常用于检验空间学习能力和参考记忆。本实验观察到，经三神散治疗后，大鼠 Morris水迷宫逃避潜伏期同模型组相比缩短，差异有显著性意义(P<0.01)，提示VD大鼠空间学习记忆得到改善。三神散主要由龙骨、石菖蒲、远志组成，现代药理学研究表明，龙骨[6]镁离子可参与神经冲动的传递和神经肌肉应激性的维持等生理功能活动，它可使运动神经末稍乙酰胆碱释放减少，具有中枢抑制和骨骼肌松弛作用。远志[5]水煎可通过提高体内抗氧化能力，清除衰老或老化机体过多生成的自由基，抑制或减轻机体组织和细胞的过氧化过程，起到延缓衰老的作用。石菖蒲[4]能增加中枢神经系统的耐缺氧能力，抑制脑细胞凋亡，保护因缺血、缺氧引起的神经功能减退。实验结果证明三神散能提高Ach和SOD含量，降低MDA含量，改善学习记忆功能。

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[4] 胡锦官，顾健，王志旺．石菖蒲及其有效成分对学习记忆的实验研究[J]．中药材，1999。22(11)：584

[5] 陈勤，曹炎贵，张传惠．远志皂苷对淀粉样肽和鹅膏钧氨酸引起的胆碱系统功能降低的影响[J]．药学学报，2002，37(12)：913-917．

[6] 管孝鞠，袁伯俊.中药促智药研究进展[J].中药新药与临床药理，1997，8(1)：55