TLC-生物自显影法筛选榆叶合叶子的抗氧化活性

新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011

榆叶合叶子(Filipendula ulmaria L.)为蔷薇科蚊子草属多年生草本植物，榆叶合叶子是新疆哈萨克族民间常用药材，收载于《哈萨克药志》。榆叶合叶子味微酸涩，性平。具有收敛，降压等作用，哈萨克族民间应于主治高血压、高血脂引起的头痛、头晕、耳鸣[1]，具有悠久的哈萨克医临床用药历史和确切的疗效。此外榆叶合叶子还具有抗炎、止血、抗溃疡、抗凝血、抗肿瘤、伤口治疗、保肝、抗糖尿病和健脑等作用[2-3]。

TLC-生物自显影法是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，现主要用于对具有抗菌/真菌,抑制胆碱酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性成分的筛选[4]。榆叶合叶子中主要含有苯酚类、黄酮类和鞣质类等成分[5-6]，本文首先建立了榆叶合叶子中黄酮类物质的TLC鉴别方法，并采用TLC-生物自显影法对榆叶合叶子的黄酮类物质进行抗氧化活性成分的初步筛选。

1 仪器与材料

半自动点样仪(CAMAG LINOMAT5)，薄层色谱数码成像系统(CAMAG REPROSTAR3)，100μl微量进样针，超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1mg)，双槽展开缸(20cm×20cm)。

金丝桃苷对照品(批号：MUST-11122003)；绣线菊苷对照品(批号：00019345-104)；芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：20120226)，槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100081-2009907)，1,1-二苯基-2-苦肼基自由基乙醇(2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl，DPPH)(SIGMA)，榆叶合叶子由新疆医科大学帕力达教授采集并鉴定。其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 精密称取一定粉碎度的榆叶合叶子花和全草药材粉末0.5g，用2*50ml甲醇索氏提取法提取，减压蒸发干燥，称重后，残渣用5ml甲醇溶解配制成供试品溶液备用。

图1 不同展开系统的榆叶合叶子药材非挥发性 成分薄层色谱图 A. 乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)； B.醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶5∶1∶1)； C.丙酮-水-甲酸(20∶0.5∶0.5)； 从左至右分别为：花的样品，全草样品，混标； 混标从上至下分别为：槲皮素，绣线菊苷，金丝桃苷，芦丁

2.2 对照品溶液的制备 分取吸取绣线菊苷、金丝桃苷、芦丁、槲皮素对照品适量，以甲醇制成每1ml含0.5mg的混标溶液，作为对照品溶液。

2.3 展开系统的选择 分别吸取榆叶合叶子花和全草供试品溶液2μl和对照品溶液 2μl，点于同一薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)、醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶5∶1∶1)、丙酮-水-甲酸(20∶0.5∶0.5)3种不同展开系统展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min至斑点清晰，紫外光366nm下检视，结果见图1。通过图中斑点数目、分离度和拖尾情况确定乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)为最佳展开系统。

图2 不同检视条件下的榆叶合叶子药材非挥发性成分薄层色谱图 A.可见光下检视；B.紫外光254nm下检视； C.紫外光366nm下检视； 从左至右分别为：花的样品，全草样品，混标； 混标从上至下分别为：槲皮素，绣线菊苷，金丝桃苷，芦丁

图3 榆叶合叶子黄酮类物质抗氧化活性筛选 从左至右分别为：花的样品，全草样品，混标； 混标从上至下分别为：槲皮素，绣线菊苷，金丝桃苷，芦丁

2.4 不同检视方式的考察 分别吸取榆叶合叶子花供试品溶液2μl、榆叶合叶子全草供试品溶液2μl和对照品溶液2μl，点于同一薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)为展开系统，展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min至斑点清晰，分别在可见、紫外光254nm和紫外光366nm下检视，结果见图2。结果表明,榆叶合叶子药材薄层色谱图中金丝桃苷、绣线菊苷、芦丁和槲皮素在3种检视条件下均斑点清晰，但在紫外光366nm下检视效果更佳，表明此鉴别方法重复性好。

2.5 TLC-生物自显影法 分别吸取榆叶合叶子花供试品溶液、全草供试品溶液和对照品溶液 2μl，点于同一薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(12∶0.5∶0.5)为展开系统，展开，取出，晾干，喷以 0. 1% 1,1-二苯基-2-苦肼基自由基乙醇(2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl，DPPH)无水乙醇溶液显色，105℃加热5min至斑点清晰，105℃加热5min至斑点清晰，可见光下检视。结果见图3。薄层板呈紫色背景黄色斑点，说明榆叶合叶子中黄酮类物质有抗氧化活性。

3 讨论

本研究首先建立了榆叶合叶子黄酮类物质的TLC方法，并将TLC-薄层生物自显影法引入到对榆叶合叶子的抗氧化活性研究中，初步筛选出榆叶合叶子的黄酮类成分具有抗氧化活性，从筛选结果发现榆叶合叶子中的绣线菊苷、金丝桃苷、芦丁、槲皮素都具有抗氧化活性，由展开斑点可初步推断，四种成分的抗氧化能力为槲皮素>芦丁>金丝桃苷>绣线菊苷，但进一步的确定还需要进行定量分析，另外由筛选结果发现榆叶合叶子样品的TLC-生物自显影法薄层板上样品的斑点成条带狀，说明榆叶合叶子中含有丰富的抗氧化活性成分，且其花的抗氧化活性强于全草的，但是由于榆叶合叶子中的黄酮类成分较多，采用普通有机展开系统进行分离可以进行较好的薄层鉴别，但是用于TLC-生物自显影法时，不能较好的分离显示斑点，如何更好的运用TLC-生物自显影法将样品中的各黄酮类成分分离的更加清晰是接下来研究的重点。

[1] 王仁.哈萨克药志[M].新疆：新疆科学技术出版社，2009.

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[5] HD Smolarz，A Sokolowska-Wozniak.Chromatographic analysis of phenolic acids in Filipendula ulmaria (L.) Maxim and Filipendula hexapetala Gilib [J].Chemical & Environmental Research.，2003，12(2)：77-82.

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