追风活血膏质量标准的研究

★ 成差群 魏燕华（广州市荔湾区芳村中医医院 广州510360）

追风活血膏由马钱子、川乌、草乌、当归、乳香、没药、骨碎补等17味药材组成，具有追风祛寒、活血散瘀、消肿止痛的功效，用于治疗腰腿痛，关节痛，筋骨麻木等。本文在原标准的基础上，增加了马钱子、川乌、草乌、当归、乳香、没药的薄层鉴别，采用HPLC法对制剂中君药有效成分士的宁和马钱子碱进行含量测定，建立追风活血膏的质量标准。

1 仪器与试药

Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），紫外检测器；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DS31200 超声波清洗器（天津市东康科技有限公司）；PHS-2C 型酸度计（上海伟业仪器厂）。硅胶G板，规格为10×10 cm，厚度0.2 mm（青岛洋化工厂）。

士的宁对照品（批号：110706-200306）；马钱子碱对照品（批号：110706-200505）；乌头碱对照品（批号：16720-200410）；当归对照药材（批号：927-9907）；乳香对照药材（批号：0970-9402）；没药对照药材（批号：120967-200603），追风活血膏样品（广州中医药大学第三附属医院自制，批号：100801、100903、101101、101201、101205），乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 追风活血膏的制备方法

取追风活血膏处方量药材，除乳香、没药、海龙碎成细粉外，其余马钱子、川乌、草乌、当归、牛膝等药材酌予碎断，70%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量，提取2 小时，第1 次加8 倍量，提取1 小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩成稠膏。另取空白膏药基质12 000 g用文火熔化，待温度降至70℃后，加入上述稠膏及乳香、没药、海龙细粉，搅匀，分摊于布或纸上，即得。

3 薄层色谱鉴别

3.1 马钱子薄层色谱鉴别

取本品30 g，剪碎，加浓氨试液2.0 mL，无水乙醇100 mL，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加1%盐酸溶液50 mL使溶解，滤过，滤液加氨试液调pH 至10.0，再加氯仿萃取3 次，每次50 mL，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取士的宁对照品、马钱子碱对照品，加三氯甲烷制成每1 mL 各含2 mg 的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液（4：5：0.6：0.4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点[1]。

图1 马钱子薄层色图谱

图2 没药薄层色谱图

3.2 没药薄层色谱鉴别

取本品60 g，剪碎，照挥发油测定法（附录XD乙法）加环己烷2 mL，缓缓加热至沸。并保持微沸约2.5 小时，放置后，取环己烷溶液作为供试品溶液。另取没药对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙醚（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，立即喷以l0%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中。在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点[2]。

3.3 乳香薄层色谱鉴别

取本品60 g，剪碎，加无水乙醇100 mL，加热回流提取30分钟，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取乳香对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30℃-60℃）-乙酸乙酯（85：5）为展开剂，展开，取出，晾干，立即喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点[3]。

图3 乳香薄层色图谱

图4 当归薄层色图谱

3.4 当归薄层色谱鉴别

取本品100 g，剪碎，加甲醇250 mL，超声提取30 分钟，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷－乙酸乙酯（9：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下观察。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点[4]。

3.5 川乌、草乌薄层色谱鉴别

取本品60 g，剪碎，加浓氨试液2.0 mL，无水乙醇200 mL，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加1%盐酸溶液50 mL使溶解，滤过，滤液加氨试液调pH 至10.0，再加乙醚萃取3 次，每次50 mL，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取乌头碱对照品，加二氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（6.4：3.6：1）为展开剂，置氨蒸气饱和20分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点[5]。

图5 川乌、草乌薄层色谱图

4 士的宁和马钱子碱的含量测定

4.1 色谱条件

色谱柱：KROMASIL C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.01mol·L-1庚烷磺酸钠与0.02 mol·L-1的磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%磷酸调节pH 值2.8）（21：79）；柱温：30℃；检测波长：260 nm；流速：1.0 mL∕分；理论板数：按士的宁计算，应不低于4 000。

4.2 溶液的制备

4.2.1 供试品溶液的制备 本品除去裱背材料，剪碎，取剪碎后的膏药30 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液5 mL，混匀，放置30分钟，精密加入甲醇100 mL，密塞，称定重量，置水浴中回流提取2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，分取甲醇液，用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过，弃去初滤液，取续滤液0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得[6]。

4.2.2 对照品溶液的制备 精密称取士的宁及马钱子对照品适量，加甲醇制成0.121 mg·mL-1士的宁和0.085 mg·mL-1马钱子碱的混合对照品溶液。

4.2.3 阴性对照溶液制备 按处方量比例取除马钱子外的处方药材，制备马钱子阴性样品。取马钱子阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备，得马钱子阴性对照溶液。

4.3 专属性试验

分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各5 μL，按所定色谱条件进样并记录色谱图，结果显示，阴性样品溶液，对测定结果无干扰。色谱图见图6。

图6 追风活血膏HPLC图

4.4 线性与线性范围

精密量取士的宁与马钱子碱混合对照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μL，分别注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得士的宁和马钱子碱的回归方程分别为：Y=209.8X-55.82（r=0.9997），Y=158.3X-33.98（r=0.9999）。士的宁和马钱子碱的线性范围分别为0.30=2.42 μg和0.21=1.70 μg。

4.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，于0、2、4、6、8 小时进样检测，依法测定，士的宁和马钱子碱RSD分别为1.28%和1.96%，表明供试品溶液在8h内稳定。

4.6 重复性试验

取批号为101101的追风活血膏样品，按供试品溶液制备方法，平行操作6 份，依法测定，结果士的宁和马钱子碱RSD 分别为0.96%和2.01%，表明该方法重复性良好。

4.7 精密度试验

取士的宁和马钱子碱混合对照品溶液，依法测定，连续测定6次，结果士的宁和马钱子碱RSD分别为0.78%和0.82%，表明仪器精密度良好。

4.8 加样回收率试验

精密称取批号为101101 的样品（士的宁含量0.335 mg·g-1，马钱子碱含量0.173 mg·g-1）适量，分别精密加入士的宁对照品溶液（2.436 mg·mL-1）2.0 mL和马钱子碱对照品溶液（1.244 mg·mL-1）2.0 mL，按供试品溶液制备方法，平行操作6 份，依法测定，结果士的宁和马钱子碱平均回收率分别为99.10%和98.27%，RSD分别为1.82%和1.64%。

表1 士的宁加样回收率试验结果

表2 马钱子碱加样回收率试验结果

4.9 样品测定结果

精密称取5 批追风活血膏样品，按“4.2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表3，按照处方量计算，每g 膏药中含马钱子原粉约25 mg，参照中国药典2010 版一部马钱子含士的宁应为1.20%-2.20%，马钱子碱不低于0.80%，折算成本品每g含士的宁应为0.30-0.55 mg，马钱子碱不低于0.2 mg，考虑到药材转移率，确定本品每g 含士的宁应为0.24-0.44 mg，马钱子碱不低于0.16 mg。

表3 样品中羟甲香豆素含量测定结果（n=3）

5 讨论

5.1 关于黑膏药的质量控制标准，2010 版《中国药典》规定“膏药应乌黑发亮，油润细腻，老嫩适度，摊涂均匀，无红斑，无飞边缺口，加温后能粘贴于皮肤上且不移动，膏药软化点适宜”的外观判断及重量差异控制，上述质量控制仍多以经验方法判断，缺少全面反映黑膏药质量的客观指标和检测方法。本文在此基础上对方中的马钱子、川乌、草乌、当归、乳香、没药等进行了定性鉴别，对方中君药进行了HPLC 定量测定，可以更好的控制追风活血膏的内在质量。

5.2 为了准确测定追风活血膏样品中士的宁和马钱子碱的含量，我们对制剂的供试品溶液的制备方法进行了考察，提取方法选择了超声、加热回流、浸渍的方法，提取溶剂选择了氯仿、甲醇和乙醇，结果：氯仿作为溶剂可以将膏药的基质溶解，而得到粘稠的氯仿提取液，无法进一步处理，而采用甲醇加热回流提取的方法最佳。经方法学验证，该方法回收率较好，空白对照无干扰，能够达到控制追风活血膏质量的目的。

5.3 在样品加热回流提取过程中，需要注意避免冷凝管外部的水珠流入提取的锥形瓶中，以免提取前后提取物的总重量增加。浓氨试液加入后，应充分振摇，使浓氨试液均匀的覆盖在剪碎的膏药的表面，以保证在提取过程中膏药中的生物碱均以游离状态存在。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].第1部.北京：中国医药科技出版社，2010：47-48.

[2] 余良忠，文萍，刘丹，等. 颈腰康片质量标准研究[J]. 中成药，2009，31（11）：1 803-1 805.

[3] 邓君丽，邹爱玲. 小活络丸的薄层分析[J]. 中国医院药学杂志，2001，21（5）：312-313.

[4]李新章，唐丽华，游本刚，等.当归流浸膏质量标准的研究[J].中成药，2010，32（2）：224-227.

[5]蒋云根，陈长生，宋彦蓉，等.通络袪痹丸的质量标准[J].第四军医大学学报，2005，26（3）：235-237.

[6]刘元，宋志钊，莫海涛，等.HPLC 法测定复方中风康复片中士的宁和马钱子碱[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：74-76.