纤维素酶提取冬枣叶中总黄酮工艺的研究

张圣燕，张 成

(滨州学院化学与化工系，山东滨州256603)

冬枣为鼠李科枣属植物，具有很好的医用价值，成熟枣果中的营养成分已被研究，并被提取出来［1-2］。而冬枣叶却被大量废弃，研究表明，枣叶中含有甜味抑制剂、黄酮类化合物和生物碱等有效成分［3］。其中黄酮类化合物具有防癌抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗骨质疏松、清除自由基和抗氧化等生理活性［4］，在医药、食品领域有着重要的应用。冬枣叶中总黄酮的提取可为冬枣叶的开发利用提供新的方向。目前，总黄酮的提取方法主要有溶剂浸提法［5］、微波提取法［6］、超声波提取法［7］、超临界 CO2萃取法［8］和酶提取法［9］等，而对冬枣叶中总黄酮提取工艺的研究还较少。本文利用纤维素酶酶解细胞壁，采用纤维素酶提取冬枣中的总黄酮，研究提取条件对总黄酮提取率的影响，优化提取工艺，为冬枣叶的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冬枣叶 采摘自滨州沾化冬枣园;纤维素酶(30units/mg) 日本;芦丁标准品(纯度≥98%)

购于北京世纪奥科生物科技有限公司;无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、石油醚 均为分析纯。

Agilent8451型紫外分光光度计 美国Agilent;B-220型恒温水浴锅 北京泰克仪器有限公司;T203型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冬枣叶中总黄酮的提取工艺 冬枣叶洗净，烘干(50℃)至恒重，粉碎，过 40目筛，石油醚(60～90℃)浸泡30min后，超声脱脂20min，过滤。重复1次。残渣挥干溶剂后，密封备用。

准确称取预处理好的冬枣叶粉末1.0g，加入70%的乙醇溶液和纤维素酶，进行酶提取，提取后过滤，得总黄酮的粗提取液。

1.2.2 标准曲线的绘制 准确称取芦丁标准品10.92mg，溶解后，转移至50mL容量瓶中，70%的乙醇定容，制成浓度为0.2184mg/mL的芦丁标液。

准确量取芦丁标液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于6支10mL容量瓶中，分别加入5%的亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，然后加入10%的硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加入4%的氢氧化钠溶液4.0mL，70% 的乙醇定容，摇匀，静置 15min［5］。以试剂空白为参比，在510nm处测吸光度，做芦丁浓度-吸光度标准曲线，得回归方程为:A=13.02913×C+0.033，其线性相关系数为R2=0.9994。

1.2.3 总黄酮含量的测定 将总黄酮的粗提取液转移到100mL容量瓶中，70%的乙醇定容，摇匀后，待用。准确吸取3.0mL定容液于10mL容量瓶中，加入显色剂(5%亚硝酸钠溶液0.3mL，10%硝酸铝溶液0.3mL，4%氢氧化钠溶液4.0mL)后，定容，摇匀，静置15min，以试剂空白为参比，在510nm波长下，测定吸光度，根据标准曲线方程计算浓度，得出提取率。

总黄酮的提取率(%)

式中:C-总黄酮浓度，mg/mL。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 提取温度对总黄酮提取率的影响 料液比为1∶40(g/mL)，酶用量为3mg/g，提取温度分别为35、45、55、65、75℃，提取时间为 90min 的条件下，提取冬枣叶中的总黄酮，测定并计算提取率。

1.2.4.2 提取时间对总黄酮提取率的影响 料液比为1∶40(g/mL)，酶用量为3mg/g，提取温度为55℃，提取时间分别为30、60、90、120、150min 的条件下，提取冬枣中的总黄酮，测定并计算提取率。

1.2.4.3 酶用量对总黄酮提取率的影响 料液比为1∶40(g/mL)，酶用量分别为 1、2、3、4、5mg/g，提取温度为55℃，提取时间为90min的条件下，提取冬枣中的总黄酮，测定并计算提取率。

1.2.4.4 料液比对总黄酮提取率的影响 料液比(g/mL)为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，酶用量为4mg/g，提取温度为55℃，提取时间为90min的条件下，提取冬枣中的总黄酮，测定并计算提取率。

1.2.5 正交实验 在上述单因素实验的基础上，以提取温度、提取时间、酶用量、料液比为因素设计正交实验，以确定冬枣叶中总黄酮的最佳提取工艺条件，因素水平见表1。

表1 L9(34)正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取温度对总黄酮提取率的影响 由图1可以看出，总黄酮的提取率最初随着提取温度的升高而增加，当提取温度达到55℃左右时，总黄酮的提取率达到最高，继续升高温度，总黄酮的提取率开始降低。这是因为，温度较低时，纤维素酶的活性较低，提取效果较差，随温度的升高，酶的活性逐渐增强，提取率增加，但当温度超过55℃后，纤维素酶开始变性失活，导致总黄酮的提取率开始降低。

图1 提取温度对总黄酮提取率的影响曲线Fig.1 Influence of extraction temperature on total flavones extraction rate

2.1.2 提取时间对总黄酮提取率的影响 由图2可见，随着提取时间的增长，总黄酮的提取率逐渐增加，当提取时间达到90min后，总黄酮的提取率增加不明显。这说明在90min时，提取效果已基本达到最佳，再延长提取时间对黄酮的提取率无显著影响。

图2 提取时间对总黄酮提取率的影响曲线Fig.2 Influence of extraction time on total flavones extraction rate

2.1.3 酶用量对总黄酮提取率的影响 由图3可见，总黄酮的提取率随着酶用量的增加而增加，当纤维素酶用量达到4mg/g左右时，总黄酮提取率增加变缓慢。这表明，当酶用量达到4mg/g时，冬枣叶黄酮的提取效果已趋于最佳，再增加酶用量，对黄酮的提取率影响不大，且造成材料浪费。

图3 酶用量对总黄酮提取率的影响曲线Fig.3 Influence of enzyme amount on total flavones extraction rate

2.1.4 料液比对总黄酮提取率的影响 由图4可见，总黄酮提取率随着料液比中溶剂量的增加先增加后降低，当料液比为1∶40时，提取率达到最大。这是因为，溶剂量的增大，使得总黄酮的溶出量增加，引起提取率增加;但溶剂量的增加也引起一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量增多，这些成分与黄酮类物质竞争乙醇-水分子，可导致黄酮的溶出量减少，从而降低总黄酮的提取率［10］。

图4 料液比对总黄酮提取率的影响曲线Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on total flavones extraction rate

2.2 正交实验

由表2结果可知，各因素对总黄酮提取率的影响程度依次为:B＞A＞C＞D，即:提取温度＞提取时间＞酶用量＞料液比。最佳提取条件为A2B2C2D3，即:提取时间为90min，提取温度为55℃，酶用量为4mg/g，料液比为 1∶50(g/mL)。

表2 L9(34)正交实验结果表Table 2 Results of orthogonal test

2.3 验证实验

选用最佳提取条件组:提取时间90min，提取温度55℃，纤维素酶用量4mg/g，料液比1∶50(g/mL)重复实验3次，进行验证，实验数据见表3，3次实验的平均提取率为2.45%。

表3 正交实验优化条件下总黄酮提取率Table 3 Total flavones extraction rate under optimal condition with orthogonal test

由表3可知，A2B2C2D3条件下冬枣叶中总黄酮的提取率高于表2中的最高提取率(2.3040%)，故A2B2C2D3为最优化实验条件。

2.4 对比实验

在最佳工艺条件下，分别采用乙醇浸提法(提取温度80℃，提取时间4h，料液比1∶20(g/mL))和酶解法(提取温度55℃，提取时间 90min，料液比1∶50(g/mL)，酶用量4mg/g)提取冬枣叶中的总黄酮，测定含量，比较提取率。

表4 提取工艺对总黄酮提取率的影响Table 4 Influence of extraction technologies on total flavones extraction rate

由表4可见，在最佳条件下，酶解法的提取率为2.45%，乙醇浸提法的提取率为1.32%。可见，相对于乙醇浸提法而言，酶解法可降低提取温度，缩短提取时间，提高冬枣叶中总黄酮的提取率。

3 结论

本文采用纤维素酶提取冬枣叶中的总黄酮，在单因素实验的基础上，进行了多因素正交实验，确定了纤维素酶提取冬枣叶中总黄酮的最佳工艺条件，即:料液比 1∶50(g/mL)，提取温度 55℃，提取时间90min，酶用量4mg/g。在最佳提取条件下，提取率可达2.45%。同时得到各影响因素对冬枣叶中总黄酮提取率的显著性影响顺序为:提取温度＞提取时间＞酶用量＞料液比。

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