鱿鱼墨多糖对环磷酰胺诱导的小鼠肠道黏膜损伤的保护作用及初步机制研究

曹 露，左 涛，李学敏，于 卿，曹斌斌，王静凤，王玉明，薛长湖，唐庆娟

化疗是目前世界上公认的肿瘤三大治疗方法之一，由化疗引起的消化道不良反应给患者造成了极大的痛苦［1］。环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)是目前临床上常用的化疗药物，作用机制是能够杀伤增殖迅速的组织细胞。但是，环磷酰胺在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤正常组织的细胞，特别是人体中生长旺盛的胃肠组织细胞，因而导致各种胃肠道不良反应，如恶心、呕吐、腹泻等［2］。据报道，全世界每年有50万患者受此症干扰。寻找能够预防化疗药物胃肠道不良反应的生物活性物质，对于提高肿瘤患者的生活质量、保证化疗效果具有重要意义。

鱿鱼墨是丰富易得的海洋生物资源。研究证实，鱿鱼墨主要由黑色素和富含岩藻糖的黏多糖组成［3］。大量的研究表明，鱿鱼墨汁具有止血［4］、抗凝血［5］、抗菌［6］、抗辐射［7］、抗氧化［8－9］、升高白细胞［10］等多种生理活性，是一种极具潜力的天然药物资源。北太平洋鱿鱼(Ommastrephes bartrami)，属真鱿科，赤鱿属。其个体墨囊相对较大，是目前世界上主要捕捞和加工的鱿鱼品种。本课题组分离纯化了北太平洋鱿鱼墨多糖，对其化学结构及抗凝血活性进行了研究;并且，在环磷酰胺腹腔注射构建化疗小鼠模型基础上，证实该多糖具有提高化疗小鼠肠道SIgA分泌的作用，提示其具有保护肠道黏膜的作用(论文另发表)。

本文拟深入研究北太平洋鱿鱼墨多糖对化疗小鼠肠道黏膜损伤的保护作用，并对其作用机制进行初步探讨，旨在为开发以鱿鱼墨多糖为功效因子的辅助化疗保健食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂、动物 注射用环磷酰胺(批号:12042725)为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。北太平洋鱿鱼墨多糖为中国海洋大学食品科学与人类健康实验室制取。Balb/c近交系小鼠，♂，7－8周龄，体质量(20±2)g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［动物合格证编号:SCXK(京)2012-000］。BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)购于碧云天生物技术研究所。超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(A001-3)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(A003-1)购于南京建成生物工程研究所。

1.2 动物实验 Balb/c小鼠于动物房适应饲养1周后，按照体重随机分为5组，每组10只，即正常组、环磷酰胺模型组、鱿鱼墨多糖低剂量组50 μg·g－1bw、中剂量组 100 μg·g－1bw、高剂量组 200 μg·g－1bw。正常组、模型组经口灌胃生理盐水作为对照，各剂量组经口灌胃相应浓度的鱿鱼墨多糖，1次/天，连续 28 d。d 26，27，按 50 μg·g－1bw 的剂量腹腔注射环磷酰胺建立化疗小鼠模型，正常组小鼠腹腔注射等体积生理盐水作为对照。d 29将小鼠摘眼球处死，取小肠组织备用。

1.3 形态学观察 取小肠空肠段约3～4 cm置于10%中性甲醛中固定，常规石蜡包埋后制作石蜡切片，并进行HE染色，光镜下观察并拍照记录。每组取5只小鼠的切片，每只小鼠取3个不同视野，每个视野随机选择5个完整的绒毛－隐窝单位进行测量小肠绒毛高度(以肠腺绒毛连接处到绒毛顶端为准)、隐窝深度(以肠腺绒毛连接处到肠腺基部为准)，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C比值)。

1.4 差异蛋白分析 取小肠回肠段约3 cm，加入RIPA裂解液匀浆。经BCA法进行蛋白浓度测定后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯亮蓝染色。显影结果经凝胶成像系统(GIS-2008型，上海天能)灰度扫描、拍照。取特异性高表达的蛋白条带，委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成质谱鉴定。主要内容包括:脱色，酶解，ABI 4800串联质谱(Maldi-Tof-Tof/MS)分析，氨基酸序列比对后获得特异性蛋白质的详细信息。

1.5 小肠匀浆上清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的测定 小肠组织匀浆后取上清，按照试剂盒说明书进行。采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力，采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

2 结果

2.1 鱿鱼墨多糖对小鼠饮食、腹泻状况和体重的影响 正常组小鼠的进食量与饮水量均无明显变化，无腹泻现象发生;其余各组小鼠在注射环磷酰胺后均出现体重减轻的现象，其中，高剂量组下降的幅度最小，中剂量组下降的幅度最大，模型组次之(Fig 1)。此外，各组小鼠的进食量及饮水量也有所减少，其中部分小鼠出现腹泻现象，粪便呈稀黄状;注射环磷酰胺后d 3腹泻现象加重，小鼠活动量减少，尤以模型组表现最为严重。

2.2 鱿鱼墨多糖对小肠绒毛高度、隐窝深度及V/C值的影响 模型组小鼠小肠绒毛长度低于正常组小鼠，且差异有显著性(P＜0.01);与模型组相比，中剂量组和高剂量组绒毛长度增加(P＜0.01)，但低剂量组降低(P＜0.01)(Fig 2)。模型组小鼠小肠隐窝深度高于正常组小鼠，且差异有显著性(P＜0.05);与模型组相比低、中、高剂量组隐窝深度降低(P＜0.01)(Fig 3)。模型组小鼠V/C值低于正常组，且有差异显著性(P＜0.01);与模型组相比低、中、高剂量组V/C值升高(P＜0.01)(Fig 4)。

Fig 1 Change of mice body weight before and after building model

Fig 2 Effects of squid ink polysaccharide onvillus length of mice(¯ ± s，n=5)

Fig 5 SDS-PAGE result of intestinal tissue

Fig 6 Mass spectrometry identification results

2.3 SDS-PAGE分析小肠组织蛋白表达差异 为了探讨鱿鱼墨多糖对化疗小鼠消化道不良反应的预防作用机制，采用SDS-PAGE蛋白电泳方法，寻找小肠组织差异表达的蛋白质(Fig 5)。对差异表达的蛋白条带A进一步脱色，酶解，进行Maldi-Tof-Tof/MS质谱分析。质谱鉴定结果显示(Fig 6)，该蛋白为谷胱甘肽巯基转移酶ω-1(glutathione S-transferases omega-1，GSTsω-1)(27 ku)。2.4 鱿鱼墨多糖对小肠组织匀浆上清中MDA与SOD含量的影响 为了探究鱿鱼墨多糖对小鼠肠道氧化应激损伤的改善作用，按照试剂盒操作步骤，检测各组小鼠小肠匀浆上清液中MDA与SOD的含量(见Tab 1、2)。与正常组相比，模型组小鼠肠道MDA含量增高，而鱿鱼墨多糖组小鼠肠道MDA含量明显下降，且低、中、高剂量组均有统计学意义(P＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.01)。与正常组相比，模型组小鼠肠道SOD活力降低，鱿鱼墨多糖组小鼠肠道SOD活力明显上升，其中高剂量组最明显(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of squid ink polysaccharide onMDA level in mice small intestine(n=10)

Tab 2 Effects of squid ink polysaccharide on SOD activityin mice small intestine(n=10)

3 讨论

环磷酰胺是治疗恶性肿瘤常用的化疗药物，具有广谱抗癌作用，是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一［11］。环磷酰胺的毒副作用主要是免疫抑制［12］和胃肠道不良反应。本课题组研究表明，连续6 d给予正常小鼠腹腔注射50 mg·(kg·bw)－1的环磷酰胺后，小肠黏膜完整性遭到破坏，小肠绒毛变短且稀疏散置，肠道SIgA分泌量减少［13］。提示可以利用环磷酰胺构建肠黏膜损伤的动物模型。

小肠是机体营养物质吸收和转运的主要部位，小肠绒毛高度的增加代表着小肠吸收营养物质的面积增大，因此，小肠绒毛的长短与小肠的消化吸收能力有密切关系［14］。小肠隐窝是绒毛根部上皮陷入固有层形成的管状腺。隐窝深度主要反映了上皮细胞的生成率，上皮细胞不断从隐窝基部向绒毛端部迁移、分化，形成具有吸收能力的绒毛细胞，以补充正常或意外损伤导致的脱落［15］。当肠道受到侵袭或应激反应时，肠绒毛就会受损变短，绒毛上皮细胞就会减少，隐窝细胞便不断产生大量具有分泌功能的未成熟上皮细胞以补充绒毛细胞，表现为隐窝深度变深，这种细胞的过量增加会导致机体腹泻的发生。绒毛高度/隐窝深度的比值(V/C值)则综合反映小肠的功能状态。比值下降，表示消化吸收功能下降，常伴随腹泻的发生。比值上升，腹泻率下降［16］。本研究结果显示:模型组小肠绒毛高度和V/C值明显低于正常组，隐窝深度明显高于正常组，说明环磷酰胺能够造成小肠黏膜上皮细胞损伤，而前期摄入鱿鱼墨多糖可以提高小肠绒毛长度，保护小肠隐窝，减少腹泻的发生，提示其对小肠黏膜损伤具有保护作用。

为了探究鱿鱼墨多糖对环磷酰胺所致小肠黏膜损伤的保护作用机制，本文进一步分析了各组之间差异性表达的蛋白质。Maldi-Tof-Tof/MS质谱鉴定结果显示，鱿鱼墨多糖高剂量组谷胱甘肽巯基转移酶ω-1(27 ku)表达量增加。谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)是普遍存在于各种生物体内的Ⅱ相代谢酶，能够水解、灭活化学致癌物代谢中亲电子疏水化合物，促其排出体外，具有解毒功能［17－18］。GSTs ω-1是GST omega家族中的一员，其在高剂量组中的特异性高表达表明鱿鱼墨多糖可以促使GSTs ω-1的产生，推测其可能参与降低肠道氧化应激损伤的反应。进一步对小肠组织匀浆液中MDA含量和SOD活力进行检测，结果证实鱿鱼墨多糖对肠道的氧化应激损伤具有改善作用。因此，鱿鱼墨多糖对环磷酰胺所致肠黏膜损伤的保护作用与它能够改善肠道氧化应激损伤有关。

本研究在分析小肠组织差异表达蛋白质的过程中发现，与模型组相比，鱿鱼墨多糖高剂量组的蛋白条带明显增多，提示该组小鼠小肠组织一些蛋白质出现特异性表达增高，具体机制有待进一步研究。

本研究表明环磷酰胺能够造成小鼠肠黏膜结构损伤，鱿鱼墨多糖前期摄入可以保护小肠绒毛、隐窝，维持肠黏膜屏障的完整性，上述作用与其提高小肠抗氧化应激能力有关。本文研究结果为开发以鱿鱼墨多糖为功效因子的辅助化疗保健食品提供了一定的理论依据。

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