超声微波协同萃取蜂胶中黄酮类物质的研究

余晶晶，童群义

（江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

蜂胶是由蜜蜂从植物芽孢和枝条上采集的树脂分泌物与蜜蜂消化腺分泌液和蜂蜡混合之后形成的一种具有黏性的天然混合物[1]。迄今为止，人们从蜂胶中已分离并鉴定出的物质有300多种，包括黄酮类、酚类、醇类、酯类、烃类、氨基酸等，其中黄酮类化合物是蜂胶的主要功能性成分，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、降血脂、增强免疫力的药理作用[2-4]，所以蜂胶现已成为各国在医药食品领域研究的热点。我国是蜂产品生产大国，蜂胶原料来源非常丰富。原蜂胶中含有较多杂质，不能直接给人服用，所以在蜂胶进行深加工前必须对蜂胶进行提纯，国内外用于食品和药品的蜂胶主要采用乙醇、水或超临界CO2做提取溶剂，用这些溶剂主要提取蜂胶的活性成分黄酮类物质[5]。研究表明水的提取率明显低于乙醇[6]，而超临界CO2萃取是近代提取分离中的一种新型分离技术，具有萃取速度快、效率高、无污染的特点，但其方法要求的装备复杂，故投资成本较高[7]。超声微波协同萃取法是固体萃取中超声波法及微波法发展而来的新技术新方法[8]。此法充分利用超声波振动的空化作用[9]及微波的高能作用[10]，克服了常规浸提、超声波和微波萃取之不足，实现了低温常压环境下，对固体样品快速，高效、可靠的处理，成本相对超临界CO2萃取也较低。目前关于该提取方法在蜂胶应用方面研究还比较少。本文以粗蜂胶为提取原料，以乙醇为提取溶剂，通过单因素实验和正交实验研究得出提取蜂胶中总黄酮的最优工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗蜂胶 江苏省庆缘康生物科技有限公司，冷冻粉碎过60目筛，低温保藏；芦丁（标准品，≥98%）阿拉丁试剂有限公司；无水乙醇、AI（NO3）3、NaNO2、NaOH 国药试剂有限公司，分析纯。

CW-2000超声微波协同萃取仪 超声波固定频率40kHz，功率50W，上海新拓分析仪器科技有限公司；UV-2100紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；AB104-N电子天平 Mettler-Toledo Instr（ShangHai）Ltd；FA1004电子天平 上海天平仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂胶中总黄酮含量与提取率的测定

1.2.1.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的芦丁标准品0.03272g置于100mL容量瓶，用无水乙醇配制成0.3272mg/mL的芦丁标准溶液，准确量取0、1、2、3、4、5mL分别加入第1～6号容量瓶（25mL）中，加水至6mL，加5%NaNO2溶液lmL，摇匀，静置10min，然后加10%Al（NO3）3溶液lmL摇匀，静置10min；再加入4%NaOH溶液10mL，50%乙醇溶液稀释至刻度摇匀放置15min。以空白溶液作为对照，用1cm比色皿于510nm处测量吸光值，以芦丁溶液浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线。

标准曲线为：y=12.806x-0.0096，R2=0.999。

1.2.1.2 总黄酮含量的测定[9]取蜂胶提取液，用无水乙醇稀释定容至250mL，然后取1mL稀释液于25mL容量瓶中，以下按制作标准曲线的方法操作，测定吸光度，从标准曲线中查出溶液黄酮浓度（mg/mL）。

总黄酮（以芦丁计，%）=c×V×K/m×103×100

式中：c为从标准曲线查得的黄酮浓度，mg/mL；V为蜂胶黄酮提取液中体积，mL；K为提取液稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.1.3 提取率的测定 将超声微波协同萃取过的蜂胶液通过真空泵经布氏漏斗抽滤到锥形瓶中，抽滤前称量滤纸质量，再用少量乙醇冲洗萃取容器和滤纸多次，将残渣及滤纸在室温下干燥至恒重。

提取率（%）=（W－W1＋W2）/W×100

式中：W为粗蜂胶质量，g；W1为滤纸质量+滤渣质量，g；W2为滤纸质量，g。

1.2.2 超声微波协同萃取蜂胶中的黄酮

1.2.2.1 单因素实验 以蜂胶提取液中黄酮含量及蜂胶提取率为指标，考察乙醇浓度、料液比、微波功率、提取时间四个因素对提取效果的影响，以确定后续正交实验各因素水平。

a.乙醇浓度对提取效果的影响：准确称取粗蜂胶1.0g，确定料液比1∶20（W∶V），提取时间60s，微波功率100W不变，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%的条件下进行微波超声协同萃取，萃取后抽滤定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分别测定黄酮含量及提取率。

b.料液比对提取效果的影响：准确称取粗蜂胶1.0g，确定乙醇浓度70%，提取时间60s，微波功率100W不变，料液比（W∶V）分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的条件下进行微波超声协同萃取，萃取后抽滤定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分别测定黄酮含量及提取率。

c.提取时间对提取效果的影响：准确称取粗蜂胶1.0g，确定乙醇浓度70%，料液比1∶20（W∶V），微波功率100W不变，提取时间分别为30、60、90、120、150、180s的条件下进行微波超声协同萃取，萃取后抽滤定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分别测定黄酮含量及提取率。

d.微波功率对提取效果的影响：确称取蜂胶1.0g，确定乙醇浓度70%，料液比1∶20（W∶V），提取时间60s不变，微波功率分别为50、75、100、125、150、175、200、225、250W的条件下进行微波超声协同萃取，萃取后抽滤定容至250mL，后按照1.2.1.2、1.2.1.3的方法分别测定黄酮含量及提取率。

1.2.2.2 正交实验 根据单因素实验结果，采用L9（34）的正交实验设计，进一步优化提取工艺参数。因素与水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果与讨论

2.1.1 乙醇浓度对提取效果的影响 如图1所示，提取液中总黄酮含量和提取率先随乙醇浓度的增加而增高，乙醇浓度为70%时达到最高值，后随乙醇浓度增加而下降。这可能是因为蜂胶中的黄酮类化合物，其中一些是易溶于水的，一些是易溶于乙醇的，而在超声微波的作用下，在70%浓度左右，醇溶性和水溶性的黄酮类物质都能最大程度地溶出。因此选择浓度70%左右的乙醇作为后续提取溶剂，此时蜂胶的提取率也较为理想。

图1 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction effect

2.1.2 料液比对提取效果的影响 如图2所示，液料比1∶10～1∶20时，总黄酮含量增加，在料液比为1∶20时，提取液总黄酮含量与蜂胶提取率均达到了最高值，之后这两个指标均随着溶剂用量的增加而有所下降且下降趋势比较明显。这是由于溶剂中黄酮浓度很低，溶剂量越大，与物料及溶剂边界层的黄酮浓度差也越大，扩散推动力增大，所以提取率增大，当溶剂量进一步增大时，溶剂自身的吸热效应及水分含量的增多，都会影响提取效率。另外，料液比增大，会增加原料成本及后续浓缩工艺的成本，因此选用料液比1∶20左右范围的比较合理。

图2 料液比对提取效果的影响Fig.2 Influence of solid-liquid ratio on extraction effect

2.1.3 提取时间对提取效果的影响 如图3所示，整体来说提取时间对提取效果影响不明显，提取率随时间增加呈不明显的上升趋势，黄酮含量在120s达到了最高值，之后随时间增加变化平缓甚至有所下降，这有可能是部分黄酮被破坏的缘故。以黄酮含量考虑来说，选择提取时间120s左右比较合理。超声微波协同萃取所采用的时间与传统方法相比缩短了30h以上，提取效果也优于传统方法。

图3 提取时间对提取效果的影响Fig.3 Infuence of extraction times on extraction effect

2.1.4 微波功率对提取效果的影响 如图4所示，提取液中总黄酮含量随着微波功率的增加逐步上升，功率在75W以后陡然上升，达到150W以后黄酮含量上升趋势不明显。蜂胶提取率在功率50～75W上升趋势比较明显，功率在100W以后变化不明显。这些可能是由于微波对细胞膜的破碎作用随着功率的增加而逐渐增强，从而有利于提取，当达到150W左右后提取率基本保持不变，说明黄酮类物质大部分已溶入乙醇溶液中。另外实验发现当微波在较高功率下乙醇溶液非常容易沸腾以至冲出冷凝管，影响实验，所以选用微波功率为150W左右范围的条件进行提取。

图4 微波功率对提取效果的影响Fig.4 Influence of microwave power on txtraction effect

2.2 正交实验结果与讨论

以蜂胶黄酮含量为评价指标（见表2），极差分析结果表明，各因素对提取效果影响大小顺序为A＞C＞D＞B。方差分析结果表明（见表3），A因素对结果有显著差异。因此，最佳提取条件为A1B1C3D3，即乙醇浓度65%，料液比1∶15，时间150s，微波功率175W。

表2 正交实验设计结果及极差分析Table 2 Results and range analysis of orthogonal experiment

以蜂胶提取率为评价指标（见表2），极差分析结果表明，各因素对提取效果影响大小顺序D＞B＞A＞C。方差分析结果表明（见表3），D因素即微波功率对结果有显著差异，而A、B、C因素对结果没显著差异。由表3可得出原最佳的提取条件是A3B1C2D3，但因考虑到溶剂成本，可将最优提取条件确定为A1B1C2D3，即乙醇浓度65%，料液比1∶15，时间120s，微波功率175W。

表3 正交实验方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

最佳提取工艺确定：由于实验主要以黄酮含量为主要指标，且不同提取条件下的提取率相对黄酮含量变化幅度较小，因此，最佳提取工艺条件确定为黄酮含量提取最高的组合，即A1B1C3D3，即乙醇浓度65%，料液比1∶15，时间150s，微波功率175W。

2.3 验证实验

根据选择的最佳提取条件A1B1C3D3进行提取，计算黄酮含量及提取率，得出的结果为黄酮含量为30.64%，高于正交实验（表2）的结果，且此条件下提取率为70.38%也较为理想，因此选择的最佳提取工艺可行。

2.4 不同实验方法比较

表4 不同实验方法比较结果Table 4 Comparison of different experimental methods

按照表4的因素水平，实验分别采用常规提取法、超声提取法、微波提取法、超声微波协同萃取法对蜂胶进行提取，提取结果见表4。可见超声微波协同萃取具有明显的优势，尤其是提取时间上，比常规提取法缩短了很长时间。在实验室条件下，若提取条件相同，超声微波协同萃取的效率显著比单纯的超声波提取法和单纯的微波提取法高。可能是因为超声波可以加速有效成分的扩散释放并使物料与溶剂充分混合再加上微波的高能作用共同促进了乙醇的浸入，加速了黄酮类化合物的溶出。因此，作为一种含量分析的样品处理是一种较理想的萃取方式，但这种方法因为目前设备的限制会给工业化生产带来一定的困难，如若能克服这些困难，在不久的将来无疑是一种值得考虑的新型提取技术。

3 结论

通过单因素和正交实验确定超声微波协同萃取蜂胶的最佳条件是乙醇浓度65%，料液比1∶15，时间150s，微波功率175W。该条件下，蜂胶提取液中总黄酮含量为30.64%，蜂胶提取率为70.38%。

不同提取方式的对比实验结果表明，超声微波协同萃取法的提取效率比单纯的超声波法、微波法和常规提取法显著要高，除了速度快、能耗小等优点外，还能够避免长时间高温高压条件下导致萃取活性物质的分解，克服了常规超声波和微波萃取之不足，实现了低温常压条件下，对固体样品进行快速、高效、可靠的预处理，是一种可考虑的样品处理新方式。

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