倒卵叶五加多糖脱色工艺研究

李小蓉，黄毓娟，权 彦

（陕西中医学院药学院，陕西咸阳712046）

倒卵叶五加是五加科五加属植物，多年生落灌叶木。其根和茎的成分与刺五加药用成分相似，药理临床实验证明无毒，能调整机体新陈代谢机能，增强对疾病的抵抗能力，扶正固本，益气健脾，补肾安神，助睡眠，增食欲，壮阳。对神经衰弱、冠心病、高血压、低血压症疗效显著[1]。有研究报道倒卵叶五加多糖（AOPS）具有免疫调节作用[2-3]。AOPS不仅能增强腹膜巨噬细胞的吞噬作用和特异抗体的产生，而且还能拮抗对抗肿瘤剂的抑制作用。因此对倒卵叶五加多糖的研究具有重要意义。但是，倒卵叶五加中存在的大量色素，给多糖的分离、纯化和结构鉴定带来很大困难，因此需要对多糖进行脱色的工艺优化比较研究。目前多糖脱色的方法主要有双氧水法、活性炭法和树脂法。使用活性炭脱色虽然具有原料易得，操作简单，价格低廉，脱色率较高等优点，但是由于活性炭对多糖也会产生吸附，导致多糖的损失率比较高，而且脱色后溶液中的活性炭残渣也难以完全除去。因此，该方法并不是一种非常理想的脱色方法。双氧水法脱色效率和多糖保留率较高，并且操作简单，成本较低，是一种比较好的脱色方法[4]。树脂法具有使用范围广，脱色率较高等优点，也是一种比较好的脱色方法[5]。因此，本文采用双氧水法和树脂法对倒卵叶五加多糖进行了脱色工艺的研究，以期找到适合工业化生产的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

倒卵叶五加药材 西安万寿路中药材市场；AB-8、LS-700B、803、840树脂 西安蓝深特种树脂有限公司；H2O2、苯酚、考马斯亮蓝G-250、浓硫酸、乙醚、无水乙醇等试剂 均为国产分析纯。

ZHWY-200B恒温振荡器 上海智城分析仪有限公司；FA2004电子天平 上海精科天平厂；RET basic恒温加热磁力搅拌器 IKA R公司；UV-2501PC紫外可见分光光度仪 日本岛津公司；RE52-05旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 粗多糖的提取 将倒卵叶五加药材干燥后粉碎。按料液比1∶10加水提取，在水浴锅中搅拌反应，当温度升高至80℃时开始计时2h，将提取液过滤、浓缩，浓缩液用4倍体积无水乙醇醇析，醇析液静置24h，然后真空抽滤，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚淋洗滤饼后，干燥即得倒卵叶五加粗多糖[6]。

1.2.2 树脂的预处理 新购树脂→95%乙醇浸泡24h→蒸馏水洗至无醇味→5%HCl浸泡2h→蒸馏水洗至pH为中性→5%NaOH浸泡2h→蒸馏水洗至pH为中性→95%乙醇浸泡备用。

1.2.3 双氧水法单因素实验和正交实验 双氧水法脱色的原理是基于双氧水在水溶液中电离出的过氧氢根离子HO2-去进攻色素的结果。实验中配制10mg/mL的粗多糖溶液，加入30%双氧水进行脱色。以脱色时间、脱色温度、溶液的pH和双氧水用量为单因素条件，测定不同条件下多糖溶液的脱色率，先进行单因素实验。在单因素实验基础上设计正交实验，确定最佳脱色工艺，其因素水平表见表1。

表1 双氧水法脱色正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.4 静态吸附实验 称取一定质量预处理好的AB-8、LS-700B、803、840树脂放入具塞锥形瓶中，加入一定量的粗多糖供试液，于25℃恒温水浴振摇24h后，测其吸光度值。计算脱色率、多糖保留率和蛋白脱除率。

1.2.5 树脂法单因素实验 称取一定质量预处理好的AB-8、LS-700B、803树脂放入具塞锥形瓶中，加入一定量的粗多糖供试液进行脱色，以树脂类型、脱色温度、脱色pH为单因素条件，测定不同条件下多糖溶液的脱色率、多糖保留率和蛋白脱除率。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 色素脱色率的计算 将倒卵叶五加多糖溶液于200～600nm波长范围内进行全波长扫描，发现溶液在可见光区并无吸收峰，但从430～490nm吸收呈现递减趋势。本研究在可见光区430～4900nm波长范围内选择了430、450、470、490nm这4个波长，分别测定了倒卵叶五加多糖溶液脱色前后的吸光度，发现测得的脱色率均无显著性差异，因此本研究选择脱色率接近平均值的470nm为检测波长，测定倒卵叶五加多糖溶液脱色前后的吸光度，并按下式计算脱色率。

式中：A前、A后分别为脱色前、后多糖溶液的吸光度值。

1.2.6.2 多糖保留率的计算 多糖含量的测定用苯酚-硫酸法，多糖保留率按下式计算。

式中：M前、M后分别为脱色前后的多糖含量。

1.2.6.3 蛋白脱除率的测定 蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法[7]。蛋白脱除率按下式计算。

式中，C前、C后分别为倒卵叶五加多糖溶液在脱蛋白前后的蛋白质浓度。

2 结果与分析

2.1 双氧水脱色方法的单因素实验

影响双氧水法脱色效率的主要因素有脱色时间、脱色温度、溶液pH和双氧水的用量等。

2.1.1 脱色时间的影响 固定溶液pH为8.0，脱色温度为50℃，双氧水和多糖的体积比为1∶1，考察脱色时间对脱色效果的影响，结果如图1所示。

图1 时间对脱色的影响Fig.1 Effect of time on decoloring rate

由图1可以看出，随着脱色时间的增加，双氧水脱色效果明显增大，当脱色时间达到3h时，脱色率达到最大，此后随着脱色时间的增加，脱色率提高不明显。多糖保留率一直随着脱色时间的增加而下降，这可能是由于多糖与双氧水发生化学反应的原因。实验中选择脱色时间为3h。

2.1.2 溶液pH的影响 固定脱色时间为2h，脱色温度为50℃，双氧水和多糖的体积比为1∶1，考察溶液pH对脱色效果的影响，结果如图2所示。

图2 溶液pH对脱色的影响Fig.2 Effect of pH on decoloring rate

由图2可以看出，随着溶液pH的增加，脱色率极大增加，这可能是由于双氧水在碱性条件下活性大的缘故，在pH为10.0后脱色率基本趋于恒定，说明随着溶液pH的继续增加，其对脱色的影响逐渐减弱，而多糖保留率随着溶液pH的增加一直呈现下降趋势，当溶液pH大于10时，多糖保留率急剧下降，因此实验中选择溶液的pH为10.0。

2.1.3 温度的影响 固定溶液pH为8.0，脱色时间为2h，双氧水和多糖的体积比为1∶1，考察温度对脱色效果的影响，结果如图3所示。

图3 温度对脱色的影响Fig.3 Effect of temperature on decoloring rate

由图3可以看出，脱色率随着溶液温度的升高而增加，在温度达到60℃时脱色率最高，此后随着温度的继续增加，脱色率有所降低。这可能是由于温度过高会造成双氧水分解，不利于脱色。多糖的保留率随着温度升高而降低，但其变化比较小，因此实验中选择脱色温度为60℃。

2.1.4 双氧水用量的影响 固定溶液pH为8.0，脱色时间为2h，脱色温度为60℃，考察双氧水用量对脱色效果的影响，结果如图4所示。

图4 双氧水用量对脱色的影响Fig.4 Effect of the concentration of H2O2on decoloring rate

由图4可以看出，脱色率随着体积比的增加而增加，在料液比为1∶1以后变化不大，而多糖保留率随着液料比的增加而降低，这主要是由于多糖结构中含有羟基等活性基团，双氧水用量过多，将多糖氧化的缘故，因此双氧水用量不宜过大，实验中选择双氧水和多糖溶液的液料比为1∶1。

2.2 正交设计确定最佳脱色工艺

通过正交实验L9（34）确定倒卵叶五加多糖的最佳脱色工艺。正交实验结果见表2，方差分析见表3。

由表2、表3可以看出，双氧水法脱色的影响因素大小顺序为：C>A>B>D，其中C因素及A因素各水平间有显著性差异，确定最佳脱色条件为A2B3C2D2，即选取脱色pH为10，脱色温度为60℃，脱色时间为3h，样液与试剂的体积比为1∶1，以此组合做验证实验得脱色率可达到84.45%，蛋白脱除率为9.66%，多糖的损失率为9.06%。由此可见，双氧水法具有较高的脱色率和多糖保留率，但蛋白脱除率较低。

表2 双氧水法脱色L9（34）正交实验结果Table 2 Design and results of the orthogonal test

2.3 树脂的筛选

不同树脂对多糖的脱色效果见表4。由表4可以看出，4种树脂中LS-700B树脂具有较强的脱色能力，较高的蛋白脱除率和多糖保留率。不同树脂对色素、蛋白质和多糖的吸附能力各不相同，一方面与树脂的性能有很大的关系，另一方面也与被吸附物质的性质有关。树脂的脱色原理主要有两种，一种是基于离子交换机理，即溶液中的离子和树脂上的离子进行交换，另一种是吸附机理，吸附性能的优劣是由其化学和物理结构决定的，树脂的极性和空间结构是影响吸附性能的重要因素。吸附符合极性相似原则，即被吸附物质和树脂的极性相似，吸附能力较强，反之，吸附能力较弱。从树脂性质上看，LS-700B属于阴离子交换树脂，AB-8和803属于大孔吸附树脂，840属于阳离子交换树脂，脱色率LS-700B最好，表明倒卵叶五加粗多糖中的色素可能以有机阴离子色素为主。从树脂极性看，AB-8是大孔弱极性树脂，具有疏水性表面结构，通过分子内的疏水基与吸附物质相互作用而进行吸附。AB-8脱色效果较好，表明倒卵叶五加中的多糖中色素的极性较弱。

表4 不同树脂对倒卵叶五加多糖溶液脱色效果Table 4 Comparison between decoloring effects of different resin on polysaccharide liquid of Acanthopanax obovatus Hoo

2.4 树脂脱色工艺条件的确立

以脱色率、多糖保留率和蛋白脱除率为评价指标，采用单因素法研究了树脂脱色的工艺条件，分别研究了树脂类型、脱色温度、脱色pH对脱色效果的影响。得到树脂脱色的工艺条件是：LS-700B树脂，温度为45℃，溶液pH为7.0。在该条件下的脱色率达到79.50%，蛋白脱除率达到79.10%，多糖保留率为82.80%。

3 结论

研究了双氧水法和树脂法对多糖中色素脱除率和多糖损失率影响，得到倒卵叶五加多糖的最佳脱色工艺。双氧水法脱色效率高，多糖的保留率也高。在单因素轮换的基础上进行了正交实验，得到倒卵叶五加多糖的最佳工艺为：溶液的pH为10，脱色温度60℃，脱色时间3h，样液与试剂的体积比为1∶1，在此条件下，脱色率为84.45%，多糖保留率为90.94%，蛋白脱除率为9.66%，说明双氧水对蛋白质的脱除没有明显的效果。树脂法脱色的工艺条件是LS-700B树脂，温度45℃，溶液pH为7.0。在该条件下的脱色率为79.50%，多糖保留率为82.80%，蛋白脱除率为79.10%。对双氧水法和树脂法的脱色效果进行比较，可以看出树脂法的脱色率和多糖保留率都比双氧水法低，此外，大孔吸附树脂价格昂贵，种类较多，使用前需要进行树脂的筛选，操作比较繁琐。因此，对倒卵叶五加多糖，双氧水法是一种较好的脱色方法。

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