响应面法优化枸杞皮渣中类胡萝卜素提取工艺

王晓璇，牛黎莉，张盛贵

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

枸杞（Lycium barbarum）素有“红宝”之称，不但有较高的营养价值，其具有的调节人体免疫力、抑制肿瘤生长、防止和阻隔癌细胞突变等方面的医疗保健作用也为人们重视[1-2]。枸杞色素是存在于枸杞浆果中各种呈色物质的总称，主要由类胡萝卜素及其他有色物质组成[3]。何进[4]测定了枸杞中色素物质量分别为β-胡萝卜素95.9μg/g、β-稳黄素32.5μg/g、玉米黄素0.149mg/g、β-隐黄质棕榈酸酯0.1457mg/g、玉米黄素双棕榈酸酯1.922mg/g。目前枸杞色素的提取方法主要是有机溶剂提取[5]，Sachindra等[6]用油脂提取法对虾皮中的类胡萝卜进行研究，还有学者采用超声波[7]、微波[8]、酶解[9]等为辅助方法提取色素，取得较好效果。熊犍等[10]采用超声波辅助有机溶剂提取玉米类胡萝卜素，所得到的玉米类胡萝卜素的质量浓度是无超声辅助时的16.25倍。近年来，枸杞色素的分析研究虽然备受关注，但关于枸杞皮渣中色素的超声波、微波辅助提取工艺的研究还鲜见报道。本文采用超声波-微波联合辅助有机溶剂法，提取枸杞皮渣中类胡萝卜素，以提取量为评价指标，采用Box-Behnken实验设计，分析超声功率、微波功率和样品颗粒度对类胡萝卜素提取量的影响，并采用响应曲面法（RSM）优化提取工艺参数，确定超声波-微波联合辅助有机溶剂法提取枸杞皮渣中类胡萝卜素的最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞 采自甘肃省景泰县；乙酸乙酯、无水乙醇、无水硫酸钠、BHT 均为分析纯。

T6新世纪紫外可见分光光度计 中国北京普析通用仪器有限责任公司；DD-5M离心机 中国长沙湘仪离心机仪器有限公司；FA2004B电子天平 中国上海越平科学仪器有限公司；JY96-ⅡN超声波细胞粉碎机 宁波新艺生物科技股份有限公司；ML-2080EGC微波炉 海尔微波制品有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺流程 选取经榨汁后的枸杞皮渣在50℃条件下烘干→原料粉碎→称取0.1g样品（精确到0.001g）→加入有机溶剂25mL（乙酸乙酯∶乙醇=1∶1）→ 超声波处理（超声时间10min）→微波处理→恒温水浴处理1h（55℃）→离心分离（4000r/min，10min）→过滤→定容至50mL→测定类胡萝卜素提取量。

1.2.2 类胡萝卜素提取量的测定 测定参考李赫等方法并改进，在451nm处测其吸光度，以提取溶剂作空白对照。类胡萝卜素计算公式为：

式中：X-样品中类胡萝卜素的提取量（mg/100g）；A-类胡萝卜素提取液在451nm处的吸光值；V-类胡萝卜素提取液样品的体积（mL）；F-测定时类胡萝卜素提取液的稀释倍数；m-样品质量（g）。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 微波功率对类胡萝卜素提取量的影响 分别设定微波功率为160、213、267、373W，固定微波时间10s，超声波功率为270W，超声时间10min，样品颗粒度为80目，确定微波功率对类胡萝卜素提取量的影响。

1.2.3.2 超声波功率对类胡萝卜素提取量的影响 分别设定超声波功率90、180、270、360、450W，固定超声时间10min，微波功率267W，微波时间10s，样品颗粒度80目，确定超声波功率对类胡萝卜素提取量的影响。

1.2.3.3 不同颗粒度对类胡萝卜素提取量的影响 分别设定样品颗粒度40、60、80、100目，固定超声波功率270W，超声时间10min，微波功率267W，微波时间10s，确定样品粒度对类胡萝卜素提取量的影响。

1.2.4 类胡萝卜素的响应面实验设计 根据单因素实验结果，选取三个主要影响因子：微波功率（X1）、超声波功率（X2）、颗粒度（X3），运用Box-Behnken的中心组合设计原理，以类胡萝卜素提取量（Y）为指标进行响应面实验设计，优化提取的工艺条件。响应面设计因素水平如表1所示。

表1 响应面设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 模型验证 以响应面分析法优化出的工艺条件，提取枸杞皮渣中的类胡萝卜素，通过比较理论值和实验值来验证模型的有效性。

2 结果与分析

2.1 微波功率对类胡萝卜素提取量的影响

由图1可知，随着微波功率的增大，类胡萝卜素的提取量是逐渐增高的，这是由于物料吸收微波能，加快组织细胞破裂速度，使提取剂分子之间的热运动加快，从而使类胡萝卜素提取量增高，当微波功率为267W时，能从枸杞皮渣中提取出类胡萝卜素137.06mg/100g，提取量达到最高，并且与其他设定功率条件下差异显著（p＜0.05）；当微波功率超过267W时，类胡萝卜素提取量有一定程度的降低，可能的原因是微波产生的瞬间高温使体系的温度上升，有机溶剂挥发从而导致提取量下降。因此，本实验选择267W左右为最佳微波处理功率。

图1 微波功率对类胡萝卜素提取量的影响Fig.1 The effect of Microwave power on carotenoids extraction

2.2 超声波输出功率对类胡萝卜素提取量的影响

图2 超声波功率对类胡萝卜素提取量的影响Fig.2 The effect of ultrasonic output power on carotenoids extraction

由图2可以看出，超声波功率270W时类胡萝卜素提取量最高，达到137.99mg/100g，且与其他各功率条件下差异显著（p＜0.05）。在超声波输出功率为90、180W时，类胡萝卜素提取量较低，可能的原因是输出功率较低时，作用于物料上的超声强度不够，不能使其充分的受到超声波作用；随着超声波输出功率的增大，物料内部分子扩散增加，提取出来的类胡萝卜素随之增多，当输出功率在大于270W后，类胡萝卜素的提取量有一定程度的降低，考虑到高功率会对机器有一定程度的损耗，生产成本也会相应增加，因此超声波输出功率为270W左右为宜。

2.3 不同颗粒度对类胡萝卜素提取量的影响

由图3可知，颗粒度为80目的时候类胡萝卜素提取量达到最高，为137.2mg/100g，且与其他颗粒度差异显著（p＜0.05）。40目时提取量最低；随着颗粒度的增大，类胡萝卜素提取量逐渐增高，这是因为破碎程度越高，会使物料与有机溶剂接触的比表面积增加，便于类胡萝卜素的提取。当颗粒度超过80目时提取量下降，可能由于类胡萝卜素与氧气接触的比表面积增大，从而导致物料中的类胡萝卜素被氧化，因此颗粒度选择为80目左右为最佳。

图3 颗粒度对类胡萝卜素提取量的影响Fig.3 The effect of Particle size on carotenoids extraction

2.4 响应面实验结果分析

在单因素实验的基础上，利用响应面法选择最佳提取工艺，实验结果见表2。利用Design Expert软件对表2实验数据进行回归分析，得二次多元回归模型：Y=136.90+0.46X1+0.90X2-0.08X3-1.41X1X2-0.48X1X3-0.61X2X3-1.74X12-2.92X22-4.03X32。

表2 Box-Behnken实验设计与数据分析Table 2 Experiment design and data analysis of Box-Behnken

对模型进行回归方程系数显著性分析见表3。模型中二次项x12、x22、x32（p＜0.01）极显著；一次项x1、x2、交互项x1x2、x2x3差异显著；表明微波功率、超声波功率以及微波功率与超声波功率、超声波功率与颗粒度的交互作用对类胡萝卜素的提取量有显著影响。

对回归模型的方差分析（见表3）可以看出：p模型＜0.0001，表明模型高度显著，不同处理间的差异极显著；p失拟=0.0862＞0.05，说明模型失拟度不显著；模型的调整确定系数R2Adj为0.9726，说明该模型能解释97.26%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的，可以用此模型对类胡萝卜素提取量进行分析和预测。

表3 Box-Behnken实验方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken design test

响应面能直接反映各实验因子对响应值影响的大小。若一个响应曲面坡度非常的陡峭，则表明类胡萝卜素提取量对于各实验因子的改变非常敏感；反之，则表明类胡萝卜素提取量可以忍受实验因子的变异，而不影响响应值的大小。各因素之间交互作用对类胡萝卜素提取量影响的相应曲面图，如图4～图6所示。

等高线的形状能反映交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则表示两因素交互作用显著。图4、图5中等高线呈椭圆形，故超声波功率和微波功率两因素之间、微波功率和颗粒度两因素之间的交互作用显著。图6中等高线趋于圆形，表明颗粒度与超声波功率交互作用不显著。

图4 微波功率与超声功率的响应曲面图Fig.4 Response surface graph of microwave power and ultrasonic power

图4为颗粒度固定在0水平即颗粒度为80目时，超声波功率与微波功率的交互作用对类胡萝卜素提取量的影响。由图4可知，当固定微波功率不变时，随着超声波功率的增大，类胡萝卜素提取量呈现先增大后减小的趋势。当固定超声波功率不变时，随着微波功率的增大，类胡萝卜素的提取量呈现增大的趋势，当微波功率超过267W时类胡萝卜素的提取量变化趋于平稳。

图5 微波功率与颗粒度的响应曲面图Fig.5 Response surface graph of microwave power and particle size

图5为超声波功率固定在0水平即超声波功率为270W时，颗粒度与微波功率的交互作用对类胡萝卜素提取量的影响。由图5可知，当固定微波功率不变时，随着颗粒度的增大，类胡萝卜素提取量呈现先增大后减小的趋势。当固定颗粒度不变时，随着微波功率的增大，类胡萝卜素的提取量呈现先增大后降低的趋势，当微波功率超过267W时，类胡萝卜素的提取量有所下降，下降趋势不明显。

图6 颗粒度与超声功率的响应曲面图Fig.6 Responsesurfacegraphofparticlesizeandultrasonicpower

图6为微波功率固定在0水平即微波功率为267W时，颗粒度与超声波功率的交互作用对类胡萝卜素提取量的影响。由图6可知，当固定超声波功率不变时，随着颗粒度的增大，类胡萝卜素提取量呈现先增大后减小的趋势。当固定颗粒度不变时，随着超声波功率的增大，类胡萝卜素的提取量也呈现先增大后减小的趋势。超声波功率、颗粒度分别在270W左右、80目左右时类胡萝卜素提取量达到最高值。

2.5 讨论

类胡萝卜素是一类不溶于水而易溶于有机溶剂的色素，常用丙酮、石油醚、氯仿等溶剂提取，本实验所选用乙酸乙酯和乙醇（1∶1）为提取溶剂，是因为乙酸乙酯相对于丙酮和石油醚毒性更低，且提取量之间无显著性差异；随着超声时间的增加类胡萝卜素提取量也相应提高，10min后趋于平缓，考虑到长时间处理会对机器造成损耗，故超声处理时间选择10min；长时间微波处理导致有机溶剂大量挥发，故而处理时间短为宜，本实验处理时间为10s。另一方面Stphane Georg等[11]在对冻干处理下的番茄中类胡萝卜素提取量变化研究结果表明，温度对类胡萝卜素提取量影响不显著，所以本实验在55℃固定温度条件下进行提取。

本实验优化出的类胡萝卜素提取的最佳条件为：超声波输出功率为282W，颗粒度80目，微波功率275W。进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件进行类胡萝卜素提取，实际测得类胡萝卜素提取量为134.84mg/100g，与理论值（136.98mg/100g）相比，相对误差为1.56%。李晓银等[12]在柿子皮中类胡萝卜素化合物的分离鉴定及稳定性的研究结果表明：类胡萝卜素提取量为80.78mg/100g，柿皮干粉与本实验相比提取量较低，这可能是由于枸杞皮中的色素提取量要略高于柿子皮。吴灿军[13]研究枸杞色素时发现总类胡萝卜素的提取量为168mg/100g。李赫等[14]在不同成熟期枸杞中类胡萝卜素提取量的变化规律研究发现，青果期到红熟期枸杞中玉米黄素双棕榈酸酯从0.148mg/100g增加到303mg/100g，本实验提取量较低可能的原因一方面是枸杞的种类、成熟度造成的差异，另一方面本实验样品为枸杞皮渣，类胡萝卜素提取量低也符合客观实际。因此，采用响应面分析优化得到的提取参数具有一定的实用价值。

3 结论

本实验重点讨论了超声波和微波功率及样品粒度对色素提取的影响，采用Box-Behnken实验设计法，对枸杞皮渣中类胡萝卜素提取工艺优化设计。研究结果表明，类胡萝卜素提取的最佳条件为：超声波输出功率282W、颗粒度为80目、微波功率为275W，实际测得类胡萝卜素提取量为134.84mg/100g，与理论值（136.98mg/100g）相比，相对误差为1.56%。

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