CCL21-CD40L融合蛋白的肿瘤免疫实验研究

宫 婷，李鸿立，巴一

(1.天津医科大学总医院肿瘤科，天津 300052;2.天津市肿瘤医院消化内科，天津 300060）

近年来，世界多数国家大肠癌发病率呈上升趋势，北美、欧洲各国大肠癌发病率居恶性消化道肿瘤第1位［1］。抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，依赖于多种效应细胞的协调作用。树突细胞作为功能最强大的抗原提成细胞，通过行使一系列功能，包括捕获抗原、上调刺激信号、将抗原递呈并激活T细胞，在抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。但在肿瘤组织周围树突细胞多低表达或免疫功能低下，无法有效地处理和提呈肿瘤抗原。CCL21又称次级淋巴组织趋化因子，能够趋化树突细胞、初始和记忆性T细胞;CD40配体(CD40 ligand，CD40L)是肿瘤坏死因子家族成员，能够通过与B细胞及树突细胞表面的CD40相互作用，诱导细胞表型和功能的成熟，上调树突细胞的共刺激分子和一些辅助因子的表达，促进树突细胞成熟。本研究拟构建趋化因子CCL21与CD40L融合基因，利用CCL21对树突细胞的趋化活性，将内源性树突细胞富集于肿瘤部位，CD40L进一步活化树突细胞，上调共刺激分子，使得树突细胞能够将抗原-肽复合物呈递给T、B淋巴细胞，从而启动细胞免疫及体液免疫反应，两者协同发挥抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞株 小鼠结肠癌细胞C26(中国医学科学院药物研究院)，小鼠树突细胞DC2.4(Havard大学 Dana Farber博士惠赠)，6～8周龄Balb/c小鼠(中国医学科学院血液研究所)。

1.2 构建 CCL21-exCD40L真核载体［2］CCL21取编码序列全长，CD40L取胞外段编码序列，通过分子生物学方法，去掉CD40L自身胞内段，替换为 CCL21的信号肽，得到exCD40L。将CCL21与exCD40L作为融合基因的对照。设计引物:P1 TTGGATCCaccatggctcagatgatg;P2 TGCTCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGC;P3 CCGCTTCCTCCGCCTCCGCTTCCGCCTCCGCC TTATCCTCTTGAGGGC;P4 GAGGCGGAGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC CATAGAAGATTGGATAAGGT;其中划线部分为柔性肽linker，以P1和P3为引物扩增CCL21、以P2和P4扩增exCD40L，分别扩增30个循环，以扩增后的CCL21和exCD40L互为引物再次PCR扩增10个循环，即通过linker(GSSSSGSSSSGSSSS)将CCL21与exCD40L连接起来成为一个融合片段，加入P1和P2继续扩增，得到CCL21-exCD40L，酶切、连接入真核表达载体 pcDNA3.1+，共建立 4种质粒，即:CCL21-exCD40L、CCL21、exCD40L 及空载体。

1.3 CCL21-exCD40L融合蛋白表达检测 应用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)介导转染pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L至CHO细胞。取转染后72h细胞总蛋白，进行Western blot检验。一抗分别为兔抗小鼠CCL21抗体及兔抗小鼠CD40L抗体(Santa cruz公司)，稀释倍数1∶200，二抗为山羊抗兔抗体，稀释倍数1∶5000，经辣根过氧化酶系统显色，观察细胞膜上CCL21-exCD40L的表达情况。

1.4 CCL21-exCD40L融合蛋白趋化活性检测转染CCL21-exCD40L基因到CHO细胞，以CCL21及空载体为对照组，72 h后收集上清液。用趋化缓冲液(含 0.5%BSA的 RPMI 1640)调整 DC2.4细胞浓度为 2×106/ml，Transwell板上层添加 DC2.4 悬液 50μl，下层添加转染细胞上清液500，覆盖孔径8 μm的多聚碳酸酯膜，置于37℃ 5%二氧化碳孵箱孵育2 h。取出多聚碳酸酯膜，刮去上层表面残留的细胞，甲醇固定，再进行苏木精染色，每孔随机计数5个光学显微镜视野(×100)中迁移至多聚碳酸酯膜背面的细胞总数。

1.5 CCL21-exCD40L融合蛋白抗肿瘤治疗

30只小鼠分别于右侧腋下皮下注射C26细胞2×106，10d后均形成结肠癌肿瘤。分为CCL21-exCD40L融合基因组8只，CCL21组、exCD40L组各6只，空载体组、磷酸盐缓冲液组(PBS组)各5只，各组分别将相关质粒经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药，每周注射1次，4周后无痛苦处死小鼠，实验中死亡的小鼠立即解剖。剥离皮下移植瘤组织测量体积。

2 结果

2.1 pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L 真核表达载体鉴定 CCL21-exCD40L基因PCR扩增产物电泳图显示，较明亮的条带为所扩增的PCR产物。电泳显示融合基因大小约1150 bp(见图1)，与预期大小相符。重叠PCR过程中引物需多次加入且原产物混杂，电泳图中可见多条杂带。将CCL21-exCD40L基因进行测序后，插入 pcDNA3.1+真核表达载体，经 HindⅢ/XhoⅠ酶切，在约1100 bp及5400 bp处可见电泳亮带(图2)，符合插入的目的片段长度及切开的 pcDNA3.1+质粒 DNA长度，提示为pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L真核表达载体。

2.2 CCL21-exCD40L融合蛋白表达测定 在CCL21一抗标记的样品中检测到CCL21(14 kD)及 CCL21-exCD40L(约 45 kD)，CD40L 一抗所标记样品检测到 exCD40L(33 kD)及CCL21-exCD40L(约45 kD)，见图3。

2.3 CCL21-exCD40L融合蛋白趋化活性检测光学显微镜下，转染 pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L、pcDNA3.1+/CCL21、pcDNA3.1+的CHO细胞培养上清液中每视野树突细胞穿膜细胞数分别为25.87 ±5.49、26.80 ±7.81、1.73±0.96，前两组间均多于 pcDNA3.1+组(均 P＜ 0.01)，分别是 pcDNA3.1+组的 14.95 和15.49倍;而前两组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。

2.4 CCL21-exCD40L抑瘤作用观察 CCL21-exCD40L融合蛋白抗肿瘤治疗后，融合基因组肿瘤均明显缩小，8只荷瘤小鼠全部存活。各组肿瘤结节变化见表1，各组差异具有统计学意义(P ＜0.01)。

图3 Western blot检测CHO-融合基因转染细胞中融合蛋白的表达Fig.3 The expression ofCCL21-exCD40L protein tested by Western blot

3 讨论

树突细胞是体内功能最强的抗原专职递呈细胞，能够捕获一些通常会发生免疫逃避的抗原物质(如肿瘤抗原)。未成熟树突细胞捕获肿瘤抗原后可自发成熟，表达主要组织相容性抗原复合物(MHC)及共刺激分子(如CD86和CD40等)，并将其表面MHCⅠ类和Ⅱ类分子上的肽抗原递呈给T细胞，使CD8+T细胞分化成具杀伤能力的细胞毒性T淋巴细胞，后者将抗原呈递给 CD4+细胞，使其分化成 Th细胞［3］，从而引发相应的免疫应答。然而肿瘤免疫的基础研究表明，肿瘤细胞低表达或不表达MHC分子及共刺激分子，某些肿瘤细胞还能分泌产生细胞因子(如白介素-10)抑制肿瘤患者体内树突细胞的成熟及机体的免疫功能，使肿瘤细胞逃脱机体的免疫监视而无限生长［4-5］。

CCL21属于CC类趋化因子，主要表达于次级淋巴器官T细胞区的基质细胞。人和小鼠中的CCL21序列高度同源，具有86%的同源性［6］。小鼠 CCL21 具有多种亚型，即 CCL21a、-b和-c，三种 CCL21 的趋化作用基本相似［7］。本实验中克隆基因为 CCL21b亚型基因。CCL21通过与其受体CCR7结合，趋化树突细胞、初始和记忆性T细胞，对B细胞、自然杀伤细胞及自然杀伤T细胞也具有趋化作用。既往已有实验证明CCL21能够通过募集免疫效应细胞达到抗肿瘤作用。Sharma等［8］在两组小鼠肺癌模型中，一组瘤内注入CCL21，而对照组注入缓释液，发现注入CCL21组小鼠肿瘤体积明显缩小，40%的小鼠肺肿瘤明显消失，而对照组小鼠的肿瘤迅速生长，提示CCR7及其配体在抗肿瘤方面具有显著作用。

表1 各组肿瘤结节变化和荷瘤小鼠存活率比较Table 1 Compare the variation of the tumor mass and survival rates between different groups

CD40L属于共刺激分子的肿瘤坏死因子超家族成员，主要表达于CD4+T细胞［9］，其次在嗜碱性细胞、肥大细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和血小板的表面也可监测到［10］。CD40LCD40的相互作用在胸腺依赖的体液免疫和细胞免疫调控中居于重要地位。CD40L通过与B细胞及树突细胞表面的CD40相互作用，诱导细胞表型和功能的成熟，上调树突细胞的共刺激分子和一些辅助因子的表达，包括MHCⅡ、CD80、CD86 等，促进树突细胞分泌 IL-12［11］，这反过来又进一步与T细胞表面的CD28相互作用，诱导T细胞增殖和活化，诱导T细胞分泌细胞因子如白介素-1、白介素-6、白介素-8、白介素-12、肿瘤坏死因子 α［12］，进而诱导 CD4+Th细胞和细胞毒性T淋巴细胞上调其白介素-12受体的表达，增强由抗CD3抗体诱导的增殖效应，启动特异性免疫应答。

因此如果在肿瘤组织原位分泌CCL21的同时表达CD40L，用以活化被趋化来的树突细胞，募集CD4+T细胞、细胞毒性T淋巴细胞等免疫效应细胞，促进趋化而来的免疫效应细胞间相互作用，可以启动免疫应答，发挥特异性抗肿瘤作用。Khaled等［13］将分别负载CCL21基因及CD40L基因的两个腺病毒载转染C26细胞，发现转染载体的肿瘤局部富集 CD4+、CD8+T细胞;将两个基因同时于小鼠C26肿瘤模型瘤体原位注射，二者协同较单基因作用能够发挥更强的CD8+T细胞依赖的抗肿瘤作用，小鼠生存期显著延长，证明上述假设可行。但是实际应用中如果同时在肿瘤原位分别表达两种蛋白，操作步骤繁琐，不容易推广。

本研究将CCL21全长与CD40L胞外区这两个有功能的蛋白的编码序列连接起来，构建融合基因，通过转染靶细胞，使之分泌表达CCL21-exCD40L融合蛋白。DC2.4是C57B/L小鼠骨髓来源的不成熟树突细胞永生细胞系，其形态和生物学活性与小鼠骨髓来源的树突细胞相似［14］，并且用脂多糖及肿瘤坏死因子α刺激后能够向成熟方向转化，主要用于肿瘤方面的研究。本实验结果表明，融合蛋白及CCL21蛋白对树突细胞均具有明显趋化作用，也证明了融合基因中的CCL21这部分基因编码的蛋白活性能够正常发挥，与前人研究结果［8］相符。

由此我们进一步假设，如果将融合蛋白在肿瘤局部表达，融合蛋白将发挥趋化作用募集抗原负载的树突细胞、T及B淋巴细胞到肿瘤组织，其中的exCD40L部分发挥其“活化”作用，激活趋化而来的树突细胞及B细胞等，增强免疫细胞间的正反馈作用，这样“趋化”与“活化”相辅相成，协同发挥抗肿瘤的作用。本实验构建了小鼠结肠癌肿瘤模型，当肿瘤增大到直径约0.8 cm左右，用脂质体包裹CCL21-exCD40L融合基因肿瘤原位注射，结果显示肿瘤体积减小，小鼠生存期延长，生存率显著提高，实验结果与Khaled等一致。证明CCL21-exCD40L融合基因既发挥了CCL21的趋化作用，又发挥了CD40L的活化作用，两者协同作用大大提高了CCL21或exCD40L作为免疫佐剂对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究制备的CCL21-exCD40L融合基因转染效率较高，其表达的蛋白展示有很好的生物活性，但有一定的非特异性免疫反应，有待进一步改进。

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