大吴风草总黄酮含量季节动态变化及对逆境胁迫的响应

崔大练，马玉心

(浙江海洋学院海洋科学学院，浙江舟山 316000）

大吴风草(Farfujium japonicum Lindl.)又名莲蓬草，属菊科大吴风草属植物，多年生草本，分布区域从中国东南部经琉球群岛和台湾一直到日本［1］。大吴风草是重要的药用植物资源，其干燥的根状茎、叶片、叶柄均可入药，具有清热、解毒、活血的功能［2］;也是重要的园林绿化植物，宜植于大树下、高大建筑物背阴处、林地，也可布置荫蔽处的花坛、花境，常用做路旁的花境做背景或点缀，十分美丽［3］。其生境范围相当广泛，常生于低海拔的林下、山地、山谷、海滨草丛;其野生环境多为林下，郁闭度在80%以上，能成片生长，而且长势较好，土壤基质多为土质疏松、排水良好、富含有机质的土壤。随着野生资源不断被挖掘利用，人们开始人工栽培大吴风草，由于其适应性较强，即使在向阳处、土质瘠薄甚至盐碱地均能生长，所以繁殖比较容易。大吴风草的化学成分主要为挥发油、萜类(倍半萜、二萜、三萜)、酚类、生物碱类、甾体类以及脂肪酸类等［4］;目前，国内外对大吴风草的研究主要集中在生理生态、分类鉴定等方面，对大吴风草器官中黄酮类物质含量随季节性变化的动态研究及胁迫因子对总黄酮含量的影响，迄今国内外尚未见报道。为此，本研究采用乙醇超声提取-分光光度法对大吴风草不同器官在不同胁迫条件下的黄酮含量及其动态变化进行研究，为大吴风草的种植、资源保护及其黄酮类化合物的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 芦丁标准曲线的制作 根据张志良(2003)《植物生理学实验指导》的实验方法制作芦丁标准曲线［5］。

1.2 大吴风草总黄酮含量季节动态测定 大吴风草分别于 2011 年 4、6、8、10、12 月初采集于舟山市定海区长岗山森林公园，经温州大学生命与环境科学学院丁炳扬专家鉴定为菊科大吴风草属植物大吴风草(Farfujium japonicum Lindl.)的全草。实验时选择植株大小一致、生长年龄相同的大吴风草植株作为试验对象，并将其叶、叶柄、根状茎低温烘干粉碎，过100目筛，放入干燥器备用，用于测定总黄酮含量。

1.3 胁迫因子对大吴风草总黄酮含量的影响

1.3.1 不同光照下大吴风草的黄酮含量 从样地中挖取大小一致的大吴风草苗，移植于花盆中，土壤为原样地的土壤，花盆规格一致。在阴凉处缓苗1周，待苗生长良好后用于试验。光照梯度设置为全光照、一层遮阳网(50000 lux)、二层遮阳网(30000 lux)3个梯度。培养30 d后测定其根状茎、叶柄、叶片中的总黄酮含量。

1.3.2 不同水分胁迫条件下大吴风草的黄酮含量 首先测定样地中的土壤水分含量，并以其为对照土栽植的大吴风草作为对照组样品。水分胁迫设置3个梯度，即重度、中度、轻度胁迫，其含水量分别为田间持水量的80%、60%、30%。胁迫处理30 d后测定其总黄酮的含量。

1.3.3 不同盐浓度胁迫条件下大吴风草的总黄酮含量 以野生样地土为对照，分别设100 mmol/L、200 mmol/L和 300 mmol/L 3个盐度梯度，胁迫时间21 d后测定其总黄酮含量。

1.3.4 不同温度对大吴风草总黄酮含量的影响 采集大小一致的2年生大吴风草苗，分别将其栽入花盆，然后放于 5℃、15℃、20℃、25℃、30℃的光照培养箱中，每个梯度5个重复。每天定时加水，使土壤恒重。7 d后测定总黄酮含量。

1.4 试验方法 精确称定样品粉末0.5 g左右，置于50 ml容量瓶中，加95%乙醇40 ml，在超声波发生器提取45 min，静置冷却，加95%乙醇至刻度，摇匀，静止3～4 h后，吸取样液2.0 ml，分别置于25 ml容量瓶中，加水至 5 ml，再加5%亚硝酸钠1.0 ml，摇匀放置6 min，加入10%的硝酸铝1.0 ml，摇匀放置5 min，加入5%氢氧化钠10.0 ml，混匀后用水定容至刻度，摇匀，放置15 min以上，以相应试剂做空白，于510 nm处测定吸光度。从标准曲线中得到提取液黄酮的含量。

2 结果

2.1 大吴风草总黄酮含量的季节变化动态

大吴风草各个器官总黄酮含量随季节变化规律如图1所示，叶片、叶柄与根状茎总黄酮含量差异显著(F=12.00908，P ＜0.05)，叶片总黄酮含量最高，随着季节的变化有逐渐增高的趋势。4月份最低，10月份比4月份增加了24.33%，冬季12月份叶片的总黄酮含量最高，比10月份增加了25.81%。叶柄的总黄酮含量高于根状茎，而且叶柄与根状茎总黄酮含量随着季节的变化而呈波动状态，有2个高峰，1个在6月份，另1个在10月份。与叶片的总黄酮变化趋势比较，叶柄与根状茎总黄酮含量8月份较低，相对于6月份分别降低了1.4%、24%，而冬季12月份最低，相对于10月份分别降低了13.38%、19.09%。

2.2 不同胁迫条件下大吴风草总黄酮含量的变化

图1 大吴风草各个器官总黄酮含量的季节变化Fig.1 Seasonal variation of the total flavonoid content of Farfujium japonicum in various organs

2.2.1 不同光照条件下大吴风草总黄酮含量的变化 光照是影响植物细胞生长及次生代谢产物积累的重要环境因子之一，不同光照条件下植物体内黄酮含量明显不同［6］。从表1可以看出大吴风草叶片黄酮含量，随着光照的增强而降低，但差异无统计学意义(F=1.6574，P＞0.05)。全光照下叶片黄酮含量相对于30000 lux光照强度时减少了18.8%，相对于50000 lux光照强度时减少了16.3%。叶柄与根状茎随着光照的增强，黄酮含量也呈降低的趋势;但是，由于大吴风草叶片较大，对叶柄有较好的遮阴作用，光照的增强对叶柄影响不大，所以其黄酮含量变化较小，全光照下叶柄黄酮含量相对于30000 lux光照强度时减少了12.9%;相对于50000 lux光照强度时减少了10.1%。大吴风草根状茎藏于地下，受光强直接影响较小，但其黄酮含量与叶片的黄酮含量相关，一般认为黄酮是由叶片合成后运输到根部的［7］。叶片黄酮含量随着光的增强而降低，叶片合成黄酮能力减弱，根状茎的黄酮含量也将减少。

2.2.2 不同水分胁迫条件下大吴风草总黄酮含量的变化 水是植物代谢所必需的物质，它直接影响的往往是植物的初生代谢，通过初生代谢进一步影响次生代谢［8］。从表2中可以看出大吴风草叶片的黄酮含量随着土壤含水量的降低而呈增高的趋势。轻度水分胁迫、中度水分胁迫、重度水分胁迫相对于对照组黄酮含量分别增加了13.4%、18.8%、29.4%。随着土壤含水量的降低大吴风草叶柄的黄酮含量呈先增高而后降低趋势，中度水分胁迫时叶柄黄酮含量达到最大，比对照组增加了7.8%，重度胁迫时叶柄黄酮含量开始降低，比中度胁迫时降低了13.3%。大吴风草根状茎黄酮含量随土壤含水量的降低而降低，重度水分胁迫、中度水分胁迫、轻度水分胁迫相对于对照组黄酮含量分别降低了 24.61%、19.84%、8.4%。

表1 不同光照条件下大吴风草总黄酮含量Table 1 Under different light conditions total flavonoid content Farfujium japonicum

表2 不同水分条件下大吴风草黄酮总含量Table 2 Under different water conditions total flavonoid content Farfujium japonicum

2.2.3 不同盐浓度胁迫下大吴风草总黄酮含量 从表3中可以看出，随着盐胁迫浓度的增加，大吴风草叶片、叶柄、根状茎的总黄酮含量均呈下降趋势。以野外自然生长的大吴风草土壤盐度为对照(50 mmol/L)，盐度在300 mmol/L、200 mmol/L、100 mmol/L 时叶片的总黄酮含量相对于对照组分别降低了19.37%、4.8%、1.9%;叶柄的总黄酮含量相对于对照组分别降低了 36.29%、26.82%、6.97%;根状茎总黄酮含量相对于对照组降低了52.61%、40.42%、24.92%。由上述结果可知，盐胁迫能显著降低大吴风草总黄酮的含量，高盐度环境可能阻碍黄酮的合成。

2.2.4 不同温度对大吴风草各个器官总黄酮含量的影响 如图2所示，大吴风草叶片总黄酮含量随着温度的升高而增高，30℃时相对于5℃增加了41.47%;叶柄总黄酮含量表现为先降低而后增高，15℃时相对于 5℃降低了13.02%，30℃ 时相对于 15℃ 增加了 34.58%;而根状茎总黄酮含量表现为先增高而后降低的趋势，25℃时达到最高，相对于 5℃增加了41.88%，30℃相对于 25℃降低了 19.89%。

表3 不同盐浓度胁迫下大无风草总黄酮含量Table 3 Under different salt stress total flavonoid content Farfujium japonicum

图2 不同温度对大吴风草总黄酮含量的影响Fig.2 Different temperatures on the total flavonoid content of Farfujium japonicum

3 讨论

3.1 不同生长季大吴风草总黄酮含量的变化从发育进程的植物生理变化规律看，营养生长期初生代谢旺盛，次生代谢处于低谷;到生殖生长期，由于开花传粉等生理过程需要叶不断合成并转移一些生理调节物质，因而，次生代谢渐渐加强;当生长高峰期过后，次生代谢在大量初生代谢中间产物的激活下达到高峰，次生物质含量显著增加［9］。大吴风草4～8月为营养生长期，各个器官的总黄酮含量虽有所增加，但变化不大，8～10月进入花期总黄酮含量急剧增加，而且叶柄与根状茎增加幅度大于叶片，10月份以后大吴风草进入果期，根状茎与叶柄的总黄酮含量开始下降，而叶片的总黄酮含量却急剧增高。进入冬季后根状茎和叶柄中黄酮类物质含量明显降低，主要原因可能是温度太低直接影响到合成途径中关键酶的活性［10］。叶片中黄酮类物质含量却明显增加，可能由于落叶林落叶后，冬季林内郁闭度明显减小，大吴风草叶片受紫外线辐射强，有益于叶片黄酮类物质积累［11］。

3.2 生态因子对大吴风草总黄酮含量的影响

植物的代谢包括初生代谢与次生代谢［11-12］。黄酮类化合物是植物在长期的生态适应过程中为抵御恶劣生态条件、动物、微生物等攻击而形成的一大类次生代谢产物［5］。植物体内次生代谢产物的合成与积累需要环境条件的诱导［13］，环境中许多因子，如季节变化、辐射强度、营养状况、微生物侵害、机械损伤以及植物种间竞争等，都会对植物体内次生代谢产物的代谢及分布产生很大影响。光照强弱直接影响黄酮含量。以往的研究往往认为，随着光强的增强，叶片的黄酮含量将随着增加。如曹建国等比较了生长于林内、林隙和林缘3种生境的刺五加(Acanthopanax senticosus)叶片的总黄酮，发现林内生长的植物体内总黄酮含量最低，林隙植物有所增加，林缘生长的植物含量最高［14］。但是也有学者认为，适当的遮光有利于黄酮合成与积累［15］。朱肖峰等(2009年)认为，马蹄金的叶片黄酮含量当光强超过一定大小时而呈降低的趋势［16］。从本研究可以看出，随着光强的增加，大吴风草叶片总黄酮含量呈下降趋势，说明大吴风草为耐阴性植物，其光饱和点可能较低，当光强超过一定强度时，其光合能力下降，从而也影响次生代谢物质黄酮的合成与运输。由于叶柄及根状茎的黄酮来自于叶片合成与运输，所以随着光强的增强其黄酮含量呈降低趋势。

大吴风草叶由于是耐阴植物，在阳生环境仍然能生长，但是光合产物多数用于合成次生代谢产物，所以黄酮含量随胁迫强度的增加而增加［5］。根状茎的黄酮含量随水分胁迫的加剧而减少，可能是在水分胁迫下，叶片制造的次生代谢产物不能及时运输到根状茎。蔡娜(2008年)研究了苦荞麦幼苗的黄酮含量随干旱胁迫的加剧而增加［17］。石进校等人对干旱胁迫下淫羊藿总黄酮含量变化进行了研究，结果表明干旱胁迫后黄酮含量升高，并证明黄酮含量与淫羊藿早期抗旱性之间有明显相关性［18］。本实验研究结果与前人是一致的。陈光登等研究了2种淫羊藿属植物黄酮含量随着盐度的增加，呈先增高而后降低［19］。管蓝芳等也认为，低浓度盐能够促进飞廉悬浮细胞的黄酮含量，高浓度盐胁迫下，黄酮含量降低［20］。大无风草的总黄酮含量随盐度的增加而减少，说明大吴风草耐盐性较差，在较低的盐浓度条件下植物已经遭受盐毒害，所以黄酮合成下降。

总而言之，大吴风草叶片的总黄酮含量随季节变化而增加，叶柄及根状茎的总黄酮含量虽季节变化而呈波动状态，随着光强的增强，大吴风草叶片、叶柄、根状茎的黄酮含量呈下降趋势;随着水分胁迫强度的增加，大吴风草叶片黄酮含量逐渐增加，而叶柄的黄酮含量先升高而后降低，根状茎的黄酮含量逐渐降低;随着盐胁迫程度的加深，大吴风草叶片、叶柄、根状茎的黄酮含量均呈下降趋势。温度对大吴风草各个器官总黄酮含量影响不同。

［1］LIU Shangwu(刘尚武).Flora of China，Volume 77(2)(中国植物志地77卷第二分册)［M］.Beijing:Science Press，1989:1-4.(in Chinese)

［2］ZHENG Chaozong(郑朝宗).Flora of Zhejiang，Volume 6(浙江植物志第六卷)［M］.Hangzhou:Zhejiang Science and Technology Press，1993:301-303.(in Chinese)

［3］LIU Jianquan(刘 健 全).Karyomorphologyof Farfugium japonicum(Asteraceae:Senecioneae)and its systematic implication［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica(西北植物学报)，2001，21(1):159-163.(in Chinese)

［4］ZHANG Yong，ZENG Peng，JIA Qi，et al(张 勇，曾 鹏，贾 琦，等).Advances in studies on chemical constituents and pharmacological activities of Farfugium japonicum ［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草药)，2012，43(5):1009-1017.(in Chinese)

［5］ZHANG ZHiliang(张志良).Experiment Guide of Plant Physiology(植物生理学实验指导)［M］.3 ed.Beijing:Higher Education Press，2003，173-174(in Chinese)

［6］WANG Yaxing，ZANG Pu，MA Lin，et al(王亚星，臧 埔，马 琳，等).Progress in medicinal plant secondary metabolites impact factors［J］.Chin Med Biotechnol(中国医药生物技术)，2011，6(4):291-294.(in Chinese)

［7］ZHU Heng，HU Hongyou，LU Changyi，et al(诸姮，胡宏友，卢昌义，等).Progresses on flavonoid metabolism in plants and it's regulation ［J］.Journal of Xiamen University:Natural Science(厦门大学学报:自然科学版)，2007，46(增刊1):136-143.(in Chinese)

［8］XU Wenyan，GAO Weiwei，HE Chunnian(徐文燕，高微微，何春年).The impact of environmental factors on the biosynthesis of flavonoids［J］.Word Science and Technology Modernization of TraditionalChinese Medicine and Materia Medica(世界科学技术-中医药现代化)，2006，8(6):68-72(in Chinese)

［9］HUANG Xiaodong，HUANG Xiaokun，ZHANG Yueqiong(黄晓冬，黄晓昆，张月琼).Study on microwave-alkaliwaterextraction technics and dynamic content of total flavonoids in Syzyginm buxifolium leaves ［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences(安徽农业科学)，2008，36(11):4382-4385.(in Chinese).

［10］LENG Pingsheng，SU Shuchai，WANG Tianhua，et al(冷平生，苏淑钗，王天华，等).Effects of light intensity and lightquality on photosynthesis，flavonol glycoside and terpene lactone contents of Gingo biloba L.seedlings［J］.Journal of Plant Resources and Environment(资源与环境学报)，2002，11(1):1-4.(in Chinese)

［11］PAN Ruichi(潘瑞炽).Plant Physiology(植物生理学)［M］.Beijing:Higher Education Press，2008.(in Chinese)

［12］SU Wenhua，ZHANG Guangfei，LI Xiuhua，et al(苏文华，张光飞，李秀华，等).Relation ship between accumulation of secondary metabolism in medicinal plant and environmental condition［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草药)，2005，36(9):1415-1418.(in Chinese)

［13］CAO Jianguo，ZHAO Zehai，WANG Wenjie，et al(曹建国，赵则海，王文杰，等).Study on the content of syringing and total flavonoids of different Acanthopanax senticosus in three different habitats［J］.Bulletin of Botanical Research(植物研究)，2005，25(2):205-209.(in Chinese)

［14］ZHOU Shuguang，KONG Xiangsheng，ZHANG Miaoxia，et al(周曙光，孔祥生，张妙霞，等).Effects of shading on photosynthesis，and other physiological and biochemical character is ties in tree peony［J］.Scientia Slvae Snicae(林业科学)，2010，46(2):56-60.(in Chinese)

［15］YANG Peifen，LI Junmin(杨蓓芬，李钧敏).Responses of the secondary metabolites contents in the leaves of Myrica rubra cv.dongkui to light and water stress［J］.Journal of Henan Agricuhural Science(河南农业科学)，2011，40(7):118-122.(in Chinese)

［16］ZHU Xiaofeng，ZHOU Shoubiao，YANG Jihui，et al(朱肖锋，周守标，杨集辉，等).Effects on leaf characteristics and total flavone content of Dichondra repensunder differentlightintensity［J］.Acta Laser Biology Sinica(激光生物学报)，2009，18(1):62-66.(in Chinese)

［17］CAI Na，DAN Rong，CHEN Peng(蔡 娜，淡荣，陈 鹏).Effects of water stress on flavonoids content of tartary buckwheat seedlings［J］.Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica(西北农业学报)，2008，17(4):91-93(in Chinese)

［18］SHI Jinxiao，YI Langbo，TIAN Yanying(石进校，易浪波，田艳英).The relationship between the quantity change of total flavone in epimedium and protective enzyme under drought stress ［J］.Journal of Jishou University:Natural Science Edition(吉首大学学报:自然科学版)，2004，25(4):80-83.(in Chinese)

［19］CHEN Guangdeng，LI Yunxiang，ZHANG Hao，et al(陈光登，黎云祥，张 浩).Effects of salt stress on growth and flavonoids content in different organs of two species of epimedium ［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica(西北植物学报)，2008，28(10):2047-2054.(in Chinese)

［20］GUAN Lanfang，XU Maojun(管兰芳，徐茂军).Effects of salt stress on the growth of Carduus crispus L.suspension cellsand production of flavonoid［J］.Journal of Anhui Agri Sci(安徽农业科学)，2009，37(28):13597-13599.(in Chinese)