推拿对坐骨神经损伤大鼠微管相关蛋白-2的影响

高玉峰,吴剑聪,于 跃,耿 楠,李小琴,于天源

(北京中医药大学,北京100029)

周围神经损伤是临床的多发病、常见病,神经再生与修复速度缓慢造成的靶器官萎缩、功能障碍是临床上面临的难点。尽管周围神经损伤的治疗有了明显提高,但还没有达到真正的形态和功能重建。应用传统的推拿疗法治疗周围神经损伤的疗效已经得到临床证实,然而推拿治疗周围神经损伤机制尚未完全揭示清楚。本实验拟通过大鼠坐骨神经损伤模型,从行为学和形态学角度,探讨推拿治疗周围神经损伤的作用机理,为临床治疗周围神经损伤提供客观的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠80只〔北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号SCXK(京)2012-0001〕,体质量约(150±10)g。购入后适应性饲养1周。动物分组:将实验动物随机分为正常组、假手术组、模型组、模型对照组、推拿组,每组16只。

1.2 仪器及试剂 按摩推拿手法模拟仪(中华人民共和国发明专利号200710187403.1),病理石蜡包埋机(沈阳市龙首电子仪器有限公司LS-100),石蜡切片机(北京弘泰嘉业科技发展有限公司Finesse 325),显微镜(麦克奥迪BA400)等。微管相关蛋白-2(MAP-2)抗体(Anti-MAP-2 antibody),生产厂家Abcam,编号ab70218。

2 实验方法

2.1 模型制备 坐骨神经夹持损伤模型[1]:先将大鼠用10%水合氯醛以0.35 mL/100g的剂量腹腔注射麻醉;然后俯卧位固定,手术区(右侧臀股交界处)剪毛、常规消毒,用手术剪沿坐骨神经走行方向剪开大约1 cm的皮肤切口,止血,用止血钳钝性分离肌肉层,暴露梨状肌下缘及坐骨神经;用弯钩镊确认所暴露的组织确为坐骨神经后,用小号持针器在距梨状肌下缘5 mm处满扣夹持坐骨神经5 s,然后逐层缝合、碘伏消毒。假手术组,预处理及显露坐骨神经的方法同造模方法,但不做夹持。除了正常组不造模外,其余各组操作同模型组。

2.2 干预方法 各组均在造模后第7天开始干预。推拿组使用手法模拟仪(按摩头为直径10 mm的圆形光滑接触面)依次刺激束缚后大鼠右侧殷门、承山、阳陵泉穴;手法模拟为点法、拨法、揉法;刺激力量为4N。每穴每法1 min,总计 9 min。正常组、假手术组、模型组不作干预;模型对照组大鼠每天束缚9 min。在治疗10次和20次后进行行为学及免疫组化学检测。

2.3 实验检测 行为学检测[2-3]:按Rivlin法制倾斜板,由两块矩形的合金板通过铰链于一端相连而成,一块作底板,另一块为移动板,表面铺约6 mm厚的橡胶垫;斜板从水平位置起绕轴旋转,斜面角度可以测出;在室温,安静状态下,将大鼠头向前,身体纵轴与斜板纵轴平行放置,角度从小到大渐增,直至大鼠停留5 s而不跌落的最大角度作斜板实验行为学评分,每只大鼠重复测量3次,取平均值。各组分别于治疗10次和20次作斜板实验行为学评分。

免疫组化学检测:各组分别于治疗10次和20次后,大鼠灌注固定,取患侧 L3～5脊髓,再注入4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋、切片,经脱蜡、水化,抗原修复,SABC法染色,脱水、透明、封片、镜检,观察蛋白表达,并用Image-Pro Plus 6.0图像软件进行积分光密度统计分析。

3 实验结果

3.1 行为学实验结果 模型组和模型对照组大鼠斜板实验评分与正常组相比明显降低(P<0.05),推拿组与模型组相比明显升高(P<0.05),并在治疗20次后推拿组与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05),见表 1。

表1 推拿治疗后斜板实验结果(±s,n=8) 度

表1 推拿治疗后斜板实验结果(±s,n=8) 度

注:与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,△P<0.05。

组 别 斜板实验评分治疗10次 治疗20次正常组 52.59±3.39 53.02±3.24假手术组 51.63±2.32 52.70±3.55模型组 43.42±2.50# 45.24±2.91#模型对照组 44.06±3.51# 45.95±2.79#推拿组 47.50±3.22#△ 51.20±2.86△

2.2 免疫组化结果 经Image-Pro Plus 6.0进行积分光密度检测,统计采用一维方差分析进行组间比较,SNK法进行两两比较。见表2。

如表2所示,模型组和模型对照组MAP-2积分光密度与正常组相比明显升高(P<0.05),推拿组与模型组相比明显升高(P<0.05),与正常组相比明显升高(P<0.05)。

表2 推拿治疗后免疫组化结果(±s,n=8)

表2 推拿治疗后免疫组化结果(±s,n=8)

注:与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,△P<0.05。

组 别MAP-2积分光密度治疗10次 治疗20次正常组 9.65±0.84 9.35±0.95假手术组 9.93±0.79 9.81±0.96模型组 12.08±0.90# 12.18±1.03#模型对照组 12.15±0.81# 12.31±0.92#推拿组 13.71±0.75#△ 13.96±0.87#△

4 讨论

微管相关蛋白-2(MAP-2)的降解、丢失,使微管解聚,影响细胞骨架的完整性,使轴浆运输发生障碍,导致神经元死亡[4]。MAP-2参与神经元发育、突起形成、突触可塑性调节,在神经元轴突和树突的发育、生长、稳定中起着重要作用[5]。许多神经元去神经后,其树突内MAP-2表达显著减弱,而在创伤后突触重建过程中,神经元树突内的MAP-2表达显著增强[6]。

本实验观察到,模型组的MAP-2表达高于正常组(P<0.05),提示大鼠坐骨神经损伤后机体自然修复过程中可应激性提高MAP-2表达。假手术组与正常组之间差异无统计学意义(P>0.05),提示坐骨神经未损伤,则不会引起MAP-2的变化。模型对照组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),说明布袋束缚不会对坐骨神经损伤大鼠MAP-2产生作用。推拿组与模型组比较MAP-2表达明显升高(P<0.05),表明推拿干预下促进机体MAP-2表达,促进神经元再生与修复过程;模型组的斜板实验行为学评分明显低于正常组(P<0.05),说明神经损伤后在自然修复过程中运动功能恢复缓慢。推拿治疗组的斜板实验行为学评分高于模型组(P<0.05),并在治疗20次后与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05),说明推拿对大鼠坐骨神经损伤后的运动功能恢复有较好的作用。这可能是通过促进MAP-2在受损神经相应节段脊髓内的表达,从而提高微管的聚合能力,对神经元胞体和突起的生长产生积极的影响,促进神经元的存活,最终改善坐骨神经大鼠的运动功能。

[1]于向民,周燕,潘晓亮,等.地塞米松对大鼠坐骨神经损伤后脊髓前角运动神经元CGRP的影响[J].中国康复,2009,24(6):367-369.

[2]郑慧敏,吴凡,于天源.周围神经损伤的行为学研究概况[J].现代医学,2009,37(2):167-169.

[3]张国平,张桓虎,张卫东.三七总皂苷对脊髓损伤大鼠斜板实验评分的影响[J].中国现代医生,2012,50(1):9-10.

[4]钱军,孙正义,马延超,等.大鼠脊髓损伤后MAP-2的表达及与运动功能恢复的相关性[J].西安交通大学学报(医学版),2006,27(5):489-492.

[5]陈永刚,耿彬,王栓科,等.神经节苷脂对大鼠脊髓损伤后微管相关蛋白-2表达的影响及意义[J].中国矫形外科杂志,2011,19(10):840-845.

[6]Oda Y,Iida Y,Kondo Y,et al.Wood cell-wall structure requires local 2D-microtubule disassembly by a novel plasma membraneanchored protein[J].Current Biology,2010,20(13):1197-1202.