原核生物16S rRNA基因多重拷贝及其序列异化

阎永伟，张德民

(宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室宁波大学海洋学院，宁波315211)

核糖体RNA(rRNA)分子存在于所有细胞生物中，在细胞中执行恒定的功能，其分子序列既有高度保守性片段，又有相对可变性部分，其本身的进化就反映了生物系统发育历史，因此可以用来重现所有细胞生物间的进化关系［1］。Carl Wose在对100多种细胞生物的小亚基RNA分子序列比较分析的基础上提出了生物三域说，使核糖体小亚基rRNA基因(Small subunit ribosomal rRNA gene，rrs)成了原核生物系统及分类学研究的核心标识基因，在原核生物分类、鉴定与系统发生［1-4］以及细菌群落结构和多样性分析［5-7］、细菌定量等方面得到广泛应用。随着对rrs研究的深入，人们逐渐发现，细菌基因组内的rrs是多重拷贝的，有些物种中rrs各拷贝间还存在差异［8］，这种差异有时会大于不同菌株间甚至不同种间的差异。研究表明，细菌基因组内rrs拷贝数(Copy number of rrs，CN-rrs)和异化与其利用环境资源的生态策略和对环境的适应性有关。

1 原核生物基因组内的CN-rrs是原核生物种的基本特征之一

截至2012年10月31日，有1297个细菌菌株和89个古菌菌株的CN-rrs被测定，数量从1个到15个不等［8-9］，不同拷贝数的菌株所占比例见图1，1～2个拷贝rrs的菌株最多，各占20%;3～7个rrs拷贝数的菌株数也比较多，各占10%左右;8个拷贝以上的菌株相对较少。在属以上分类阶元上CN-rrs与其发育学地位没有关系。但在属的水平上，CN-rrs相对稳定，如Borrelia属8个种23个菌株都是1个，Escherichia属的2个种21个菌株全部是7个;但也有一些属的CN-rrs有一定变化，有些属中变化还比较大，如Bacillus属7～14个拷贝，Clostridium属则从4个(如C.thermocellum)到15个(如C.paradoxum)不等。在种的水平上，绝大多数细菌的CN-rrs都一致，但也有个别种有变化，如Rhodopseudomonas palustris为 1～2个，B.cereus中 12～14个，而C.botulinum中变化最大，含有8、9和11个rrs的菌株都有发现。当然，目前绝大多数种只测了1个菌株的CN-rrs，相信随着每个种所测菌株数的增多，CN-rrs稍有波动的种的比例会有所增加，但不会太多，因为前面所述，有些属的CN-rrs就是一个恒定值。所以，可以说，CN-rrs是原核生物种的基本特征之一。

图1 具有不同拷贝数16S rRNA基因的原核生物比例分布图(数据来源于rrndb数据库［9］)Fig 1 Distribution of frequency of prokaryotes with different copy number of 16S rRNA gene(Data retrived from rrndb database［9］)

2 原核生物CN-rrs与其利用环境资源的生态策略有关

rRNA是调节核糖体合成的关键因子之一，而核糖体在细胞生长、繁殖等基本生命活动中占据核心地位，因此，一般认为，细胞内CN-rrs越多，其合成rRNA越多，进而促进了核糖体的合成，因而有利于细菌达到较高的生长速度。Stevenson和Schmidt［10］在敲除E.coli的不同rRNA操纵子后，发现细胞生长停滞期延长，生长速率降低，对营养物质的竞争能力下降，整体适应能力也随之降低。但是，另有实验表明，即使在富集培养基上快速生长时，细胞内rrs合成rRNA的潜力也没有充分表现出来，因为E.coli中的7个rrs有4个失活后，其他rrs的表达活性明显提高［11］。进一步工作表明，5个rrs的表达就足够支持E.coli在复合培养基上的快速生长，但是当E.coli由胁迫条件转入适宜条件时，如由合成培养基到复合培养基，或从28℃转入42℃，7个rrs对于其快速达到新的对数生长期都有作用，每失活1 个 rrs都伴随着响应时间的延长［12，13］，说明多拷贝rrs是其适应进化的结果，赋予细菌面临可利用环境资源发生有利变化时的选择性优势［14］。但是，这种优势又带来不利的一面，就是当其处于恒定的、缓慢生长条件下，多拷贝的结构性表达产生过量的rRNA和核糖体，成为其代谢负担，反而引起生长速度的降低，且生长速度越慢，其影响越大［13，15］。

Klappenbach 等［16］提出，CN-rrs代表了细菌各发育谱系利用资源的生态策略，高CN-rrs菌对资源的输入快速响应［17］，而低CN-rrs菌则在持续的缓慢生长时有效分配资源。因此，当土壤细菌暴露于复合营养培养基上时，能在1～2 d内快速形成菌落的细菌，具有的CN-rrs平均5.5个，而延迟到5 d后形成菌落的细菌，其 CN-rrs只有1.4 个［16］。Shrestha等［18］在研究土壤微生物群落演替时发现，细菌的生长反应时间和rrs拷贝数与群落演替阶段显著相关，早期细菌多数都在1 d，个别在2 d内形成肉眼可见菌落，且多数菌株的CN-rrs大于4，而后期细菌则大多在3～15 d内形成可见菌落，且CN-rrs小于2。另外，具有rrs拷贝较少的细菌通常是寡营养细菌，生长在低营养的环境中［19，20］。

3 原核生物基因组内rrs拷贝间的异化

因菌株而异，细菌基因组内rrs各拷贝序列间既可以完全相同［8］，又可以完全不同，也可以有几个相同，又与另外几个不同［9］。如Streptococcus agalactiae 2603 V/R具有7个完全相同的 rrs，而 B.subtilis的菌株168，10个rrs序列各不相同［8］。rrs拷贝数较低的菌株中，序列相同的比例很高，如带有2个或3个rrs的菌株，序列完全相同的菌株超过70%，而8个拷贝以上的菌株都存在rrs序列的异化。通常，基因组内rrs序列间差异小于1%，但有时也会大于1%，其差异超过种内不同菌株，甚至不同种间的差异［21-23］。例如，V.splendidus菌株 PB1-10的13个 rrs拷贝分别与 V.splendidus，V.lentus，V.aestuarianus，V.tasmaniensis和 V.anguillarum等五个种聚在一起［22］;V.alginolyti-cus ATCC 17749T的 2个 rrs序列(X74690，X56576)之间的相似性只有98.8%，但序列X74690与V.harveyi CECT 525T(X74706)、V.parahaemolyticus CECT 511T(X74720)、V.campbellii 523T(X74692)、V.natriegens CECT526T(X74714)和 V.rotiferianus CECT 577T(AJ316187)等种的模式株的相似性均高于98.8%，同时，序列 X56576与 V.campbellii 523T的另一条序列(X56575)相似性也高于98.8%。我们通过PCR产物直接测序得到的该模式株的序列(JN188438)与X56576和 X74690的序列均不同，相似度分别是98.5%与99.4%，而与V.parahaemolyticus CECT 511T(X74720)、V.campbellii 523T(X74692)、V.natriegens CECT526T(X74714)和 V.rotiferianus CECT 577T(AJ316187)等种模式株的相似性均高于99.5%［23］。在极端情况下，基因组rrs间的差异超过10%，甚至20%，如 Thermoanaerobacter tengcongensis的4个rrs间的最大差异可达到11.6%，Borrelia afzelii的两个rrs拷贝的差异为 20.38%［8］。

4 原核生物基因组内rrs拷贝间异化与其对环境的适应有关

Nilsson等［24］报道，V.vulnificus的 rrs可分成 A、B两种类型。B类型与临床菌株相关，而A与环境菌株相关。另外，Lin和Schwarz［25］发现A型菌株多分离于六七月份，而B型菌株多分离于9月份。已有一些证据将rrs序列的异化与细菌的生长温度联系起来。芽孢杆菌属的B.cereus群包括两个中温菌(B.cereus和B.thuringiensis)及两个低温菌(B.mycoides和 B.weihenstephanensis)。Pruss等［26］发现，中温菌和低温菌都有其特有的rrs印迹，在22个核苷酸长的片段上(180bp to 201bp，按B.cereus的16S rDNA计算)，有3个碱基在中温菌是G或C，而在低温菌则是A或T。进一步研究发现，有些菌株2种印迹都包含，且适宜温度也介于中温菌和低温菌之间。实际上，B.cereus群的CN-rrs在6～10个之间，低温印迹和高温印迹在不同拷贝的rrs上。Guinebretiere等［27］依据AFLP指纹技术将425株B.cereus群分成7个组，其生长温度的上下限也相应地呈梯度分布，且在用rrs序列构建的系统发育树上也聚成相应的7个发育分支。嗜盐古菌Haloarcula marismortui具有3个rrs，其中2个拷贝(A和C)基本上是相同的，但另一个(B)的核苷酸序列则有较大的差异。研究发现，培养温度对rrs的表达产生了显著影响，基因B在50℃的表达量比另外一组的高4倍，而15℃时，其表达量则比后者低3倍。一个缺乏B基因的突变体在高温下生长速度较慢。但没有发现盐浓度对其表达量有影响［28］。Lauro等［29］的研究表明，Photobacterium profundum SS9的 rrs的2个螺旋臂的延伸与其嗜压生理特性有关。这些现象支持的观点是:差异的rRNA基因是对环境适应的需要，不同的基因在不同的条件下执行同样的功能。

5 展望

除了与其对环境资源利用策略有关外，原核生物的rrs拷贝数及其异化还和其细胞分化有关。例如，Schirrmeister［30］等人发现，蓝细菌细胞内 rrs的拷贝数的增加与其末端分化相关，蓝细菌门细胞内rrs的拷贝数变异(1～4个)和各拷贝间的异化度也明显低于其他门(绿细菌门、螺旋体门和拟杆菌门);Nanamiya［31］证实，含有单个rRNA操纵子拷贝的缺失突变体，其生长明显变慢，产芽胞率降低1至4个数量级。但总体上讲，目前对原核生物基因组内rrs拷贝数及其异化的生物学意义了解还是初步的，相信更多原核生物的基因组学研究的深入，将能全面揭示其对原核生物适应环境的意义［32］。另外，原核生物rrs拷贝数及其异化的研究对于避免菌种鉴定错误、纠正对原核生物丰度和多样性的高估也具有重要意义［2，33-36］。

［1］Rajendhran J，Gunasekaran P.Microbial phylogeny and diversity:small subunit ribiosomal RNA sequence analysis and beyond［J］.Microbiological Research，2011，166:99-110.

［2］N rskov-Lauritsen N.Increased level of intragenomic 16S rRNA gene heterogeneity in commensal strains closely related to Haemophilus influenzae［J］.Microbiology，2011，157:1050-1055.

［3］Brenner D J，Crieg N R，Staley J T.Polyphasic taxonomy.in:Garrity G M，et al，eds.Bergey’s manual of systermatic bacteriology［M］.2nded.New York:Springer Press，2005，2:43-48.

［4］Balows A，Rusenberg E，Schleifer K H，et al.Defining taxonomic ranks.in:Dworkin M，eds.The prokaryotes［M］.3rded.New York:Springer Press，2006，1:58-80.

［5］Lozupone C A，Stombaugh J I，Gordon J I，et al.Diversity，stability and resilience of the human gut microbiota［J］.Nature，2011，489:220-230.

［6］Gilbert J A，Steele J A，Caporaso J G，et al.Defining seasonal marine microbial community dynamics［J］.The ISME Journal，2012，6:298-308.

［7］Li X R，Ma E B，Yan L Z，et al.Bacterial and fungal diversity in the traditional Chinese liquor fermentation process［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，146:31-37.

［8］Pei A Y，Oberdorf W E，Nossa C W，et al.Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76:3886-3997.

［9］Lee Z M，Bussema C，Schmidt T M.rrnDB:documenting the number of rRNA and tRNA genes in bacteria and archaea［J］.Nucleic Acids Research，2009，37:163-168.

［10］Stevenson B S，Schmidt T M.Life history implications of ribosomal RNA gene copy number in Escherichia coli［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70:6670-6677.

［11］Condon C，French S，Squires C，et al.Depletion of functional ribosomal RNA operons in Escherichia coli causes increased expression of the remaining intact copies［J］.The EMBO Journal，1993，12:4305-4315.

［12］Condon C，Liveris D，Squires C，et al.rRNA operon multiplicity in Escherichia coli and the physiological implications of rrn inactivation［J］.Journal of Bacteriology，1995，177:4152-4156.

［13］Asai T，Condon C，Voulgaris J，et al.Construction and initial characterization of Escherichia coli strains with few or no intact chromosomal rRNA operons［J］.Journal of Bacteriology，1999，181:3803-3809.

［14］Weider L J，Elser J，Crease T J，et al.The functional significance of ribosomal(r)DNA variation:impacts on the evolutionary ecology of organisms［J］.Annual Review of Ecology，Evolution and Systematics，2005，36:219-242.

［15］Stevenson B S，Schmidt T M.Growth rate-dependent expression of RNA from plasmid-borne rRNA operons in Escherichia coli［J］.Journal of Bacteriology，1998，180:1970-1972.

［16］Klappenbach J A，Dunbar J M，Schmidt T M.rRNA operon copy number reflects ecological strategies of bacteria ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66:1328-1333.

［17］Dethlefsen L，Schmidt T M.The performance of the translational apparatus varies with the ecological strategies of bacteria［J］.Journal of Bacteriology，2007，189:3237-3245.

［18］Shrestha P M，Noll M，Liesack W.Phylogenetic identity，growthresponse time and rRNA operon copy number of soil bacteria indicate different stages of community succession［J］.Environmental Microbiology，2007，9:2464-2474.

［19］Cavicchioli R，Ostrowski M，Fegatella F.Life under nutrient limitation in oligotrophic marine environments:an eco/physiological perspective of Sphingopyxis alaskensis(formerly Sphingomonas alaskensis)［J］.Microbial Ecology，2003，45:203-217.

［20］Eichorst S A，Breznak J A，Schmidt T M.Isolation and characterization of soil bacteria that define Terriglobus gen.nov.，in the phylum Acidobacteria ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73:2708-2717.

［21］Michon A，Aujoulat F，Roudiere L，et al.Intragenomic and intraspecific heterogeneity in rrs may surpass interspecific variability in a natural population Veillonella［J］.Micriobiology，2010，156:2080-2091.

［22］Jensen S，Frost P，Torsvik V L.The non-random microheterogeneity of 16S rRNA genes in Vibrio splendidus may reflect adaptation to versatile lifestyles［J］.FEMS Microbiology Letter，2009，294:207-215.

［23］郭 静，Gadafii L，郭安南，等.溶藻弧菌相关分离株的分子及VITEK鉴定［J］.水产学报，2012，36(3):383-390.

［24］Nilsson W B，Parajpye R N，DePaola A，et al.Sequence polymorphisms of the 16S rRNA gene of Vibrio vulnificus is a possible indicator of strain virulence ［J］.Journal of Clinical Microbiology，2003，41:442-446.

［25］Lin M，Schwarz J R.Seasonal shifts in population structure of Vibrio vulnificus in an estuarine environment as revealed by partial 16S ribosomal DNA sequencing［J］.FEMS Microbiology Ecology，2006，45:23-27.

［26］Pruss B M，Francis K P，Stetten F V，et al.Correlation of 16S ribosomal DNA signaturesequences with temperature-dependent growth rates of mesophilic and psychrotolerant strains of the Bacillus cereus group［J］.Journal of Bacteriology，1999，181:624-630.

［27］Guinebretiere M H，Thompson F L，Sorokin A，et al.Ecological diversification in the Bacillus cereus group ［J］.Environmental Microbiology，2008，10:851-865.

［28］López-López A，Benlloch S，Bonfá M，et al.Intragenomic 16S rDNA divergence in Haloarcula marismortui is an adaptation to different temperatures［J］.Journal of Molecular Evolution，2007，65:687-696.

［29］Lauro F M，Chastain R A，Blankenship L E，et al.The unique 16S rRNA genes of piezophiles reflect both phylogeny and adaptation［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73:838-845.

［30］Schirmeister B E，Dalquen D A，Anisimova M，et al.Gene copy number variation and its significance in cyanobacterial phylogeny［J］.BMC Microbiology，2012，12:177.

［31］Nanamiya N，Sato M，Masuda K，et al.Bacillus subtilis mutants harbouring a single copy of the rRNA operon exhibit severe defects in growth and sporulation［J］.Microbiology，2010，156:2944-2952.

［32］Schrider D R，Hahn M W.Gene copy-number polymorphism in nature［C］.Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences，2010，277:3213-3221.

［33］Roux S，Enault F，Bronner G，et al.Comparison of 16S rRNA and protein-coding genes as molecular markers for assessing microbial diversity(bacteria and archaea)in ecosystem［J］.FEMS Microbiology Ecology，2011，78:617-625.

［34］Kembel S W，Wu M，Eisen J A，et al.Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance［J］.PLOS Computational Biology，2012，8:1-11.

［35］Bodilis J，Nsigue-Meilo S，Besaury L，et al.Variable copy number，intra-genomic heterogeneities and lateral transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas［J］.PLoS ONE，2012，7:1-14.

［36］Ki J S，Zhang R，Zhang W，et al.Analysis of RNA polymerase beta subunit(rpoB)gene sequences for the discriminative power of marine Vibrio species［J］.Microbiology Ecology，2009，58:679-691.