皖西食用百合茎尖脱毒培养

张传海，孙传伯，谢升旺，王维杰，唐文娟，程梦思

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安237012；2.安徽中升生物科技有限公司，安徽 霍山237200）

百合是百合科百合属（Lilium）植物的总称，全世界共有90余种。我国是世界百合的起源中心，原产于我国的约有46种18变种［1］。百合是药食同源的多年生草本经济作物，根据其用途可分为食用、药用和观赏百合等3类，其中，食用百合被视为“蔬菜人参”，具有润肺、祛痰、健胃、清热利尿等功效［2］。

我国拥有非常悠久的食用百合栽培历史，近年来随着人民生活水平的不断提高和百合需求量的日益增长，百合种植面积也在迅速扩大，成为宜栽地区调整农业产业结构的重要作物品种之一。地处皖西大别山区的六安市霍山、金寨、舒城、裕安等县区，食用百合的年种植面积达5万亩以上，已发展成为区域性特色农业产业［3］。然而，对霍山等地百合种植区的调查发现，近年来以灰霉病、叶尖干枯病、炭疽病以及病毒病等为主的百合病害日趋严重［4］，直接影响到百合生产的正常进行，对百合产业的健康发展构成了威胁。

现实生产中，百合的繁殖主要是依靠鳞茎进行无性扩繁，在此模式下，一旦母球感染病毒，就会在植株体内不断积累并传代，形成长期危害。要解决因病毒侵染导致的种性退化问题，利用茎尖培养技术生产百合脱毒种苗是一条可行的途径［5］。

本文以皖西食用百合主栽品种卷丹（Lilium lancifoliumThunb）的鳞茎为材料，开展百合鳞茎的茎尖离体培养研究，重点探讨不同激素条件对不定芽的诱导发生、继代增殖以及诱导生根等的影响，旨在为建立皖西食用百合脱毒种苗生产技术体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以食用百合卷丹的新鲜鳞茎为材料，湿沙埋藏备用。

1.1.2 仪器

电热蒸汽灭菌器（YX-450，上海三申），超净工作台（苏州净化），体视显微镜（SZX7-1093，奥林巴斯），恒温培养箱（PYX-150HA，科立仪器）。

1.1.3 试剂

乙醇，HgCl2，6-苄氨 基 嘌 呤 （6-BA），萘 乙 酸（NAA），MS培养基所需试剂。

1.2 方法

1.2.1 培养基的种类与配制

芽诱导的培养基：MS＋蔗糖30g／L＋0.05%活性炭＋琼脂粉4.5g／L＋植物激素组合（表1、2）；用15mm×80mm的指管进行分装。

不定芽增殖的培养基：MS＋蔗糖30g／L＋琼脂粉4.5g／L＋植物激素组合（表3）；用容积250mL、带透气孔的培养瓶分装，每瓶50mL。

诱导生根的培养基：1／2MS＋蔗糖25g／L＋琼脂粉4.5g／L＋植物激素组合（表4）；用容积250mL、瓶盖带透气孔的塑料培养瓶分装，每瓶约50mL。

上述各类培养基的配制，皆按常规流程进行，调整pH值至5.9，分装后，高压湿热灭菌，冷凝备用。

1.2.2 鳞茎的预处理

热处理组：取百合鳞茎，用自来水洗净外表，剥去外层鳞片，使鳞茎直径缩小至1.5cm左右，装于小型塑料自封袋中，置于42℃恒温培养箱中避光保温处理72h，然后进入茎尖剥离操作步骤。

未热处理组：在接种的当天，取百合鳞茎，用自来水洗净外表，剥去外层鳞片，然后进入茎尖剥离操作程序。

1.2.3 鳞茎的消毒与茎尖剥取

鳞茎的消毒：取预处理后的百合鳞茎（热处理组和未热处理组要分开），用自来水清洗外表，沥水，在超净工作台上进行表面消毒：先用75%乙醇浸润10 s，快速倒去乙醇，用无菌水浸洗2～3次，然后将鳞茎转入0.1%HgCl2溶液中浸泡消毒10min，再用无菌水清洗4～5遍，沥水，置于无菌培养皿中。

茎尖剥取和接种：消毒好的每个鳞茎，先用肉眼剥去外部鳞片，再在体视显微镜下快速剥取直径0.5～1.0mm大小的茎尖，迅速接种到各芽诱导培养基上。

1.2.4 茎尖接种和芽诱导培养

每支芽诱导指管培养基上接种1个茎尖，每个激素处理组共接种10个茎尖。接种完成后，转入光照培养箱中集中培养，诱导不定芽发生。培养条件：温度（24±2）℃，光照强度1500lx，光照时间12h／d。定期观察茎尖生长发育进程，培养至第45d，统计不定芽诱导发生情况。

1.2.5 不定芽的继代增殖培养

将茎尖诱导培养产生的不定芽分成单个后，转接到各组芽增殖培养基上进行继代培养，每个激素处理组接种5瓶、共15个不定芽，培养条件与上述芽诱导的相同。培养至30d，统计不定芽的增殖情况。

1.2.6 诱导生根培养

继代增殖后，将带叶无根芽苗分成单株，转接到生根培养基上进行生根培养，每一激素处理组接种5瓶、共15个芽苗，培养条件同芽诱导。培养至第25 d，统计生根情况。

1.2.7 数据统计分析

平均芽分化量＝诱导发生的不定芽总数／产芽的总茎尖数；不定芽诱导率（%）＝（产生不定芽的茎尖数／成活的茎尖数）×100；芽增殖系数＝增殖后的不定芽总数／接种的不定芽总数；芽增殖率（%）＝（新增殖的不定芽数／接种的不定芽总数）×100；生根诱导率（%）＝（生根的不定芽数／接种的不定芽数）×100。

2 结果与分析

2.1 不定芽的诱导发生

观察了各处理的不定芽诱导发生进程。总体上，接种后第6d左右茎尖即启动生长；第12d，成活的茎尖开始膨大变绿；第20d，不定芽明显形成，而未成活的茎尖变褐枯死；第26d，不定芽增殖形成丛芽，幼叶抽展，成为带叶的无根芽苗。

培养至45d，对不定芽的分化发生情况进行了统计分析，结果见表1和表2。在热处理组和未热处理组中，不同激素组合对不定芽的诱导效应表现出较高的一致性；热处理组和未热处理组皆以6-BA 1.0 mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素组合为优，其在热处理组的芽诱导率为88.9%，平均芽分化量为4.5个，在未热处理组的芽诱导率为87.5%，平均芽分化量为4.9个。总体上，鳞茎的热处理对于后期接种茎尖的成活和芽分化呈现负向作用，表现为芽诱导率和平均芽分化量皆有一定程度下降，但与未热处理组相比较，不定芽发生情况并无显著差异。

表1 热处理组的茎尖培养诱导不定芽发生情况

2.2 不定芽的继代增殖

将诱导发生的不定芽分组转接到芽增殖培养基中，培养至第30d，统计各激素处理组的不定芽增殖情况。结果（表3）表明，适当降低6-BA和NAA的使用浓度有利于不定芽的增殖和生长，较高浓度水平的6-BA对于不定芽的增殖反而有抑制作用。

表3 外源植物激素对茎尖培养不定芽增殖的影响

在设定的各激素处理组中，以6-BA 0.5mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素组合为佳，芽增殖系数为最高的4.20，芽增殖率为320%。而不添加任何外源激素的对照组，不定芽的增殖效率最低，表明外源植物激素对于百合不定芽的增殖培养是必需的。

2.3 外源植物激素对不定芽的诱导生根效应

本实验的生根培养基中，NAA 设置0.1、0.5、1.0、1.5mg／L共4个浓度水平，与6-BA的0.2、0.5 mg／L进行完全组合，另以不加任何植物激素的为对照组，统计结果见表4。

将不定芽接种到生根培养基上，培养至第7～10 d，不定芽的基部开始长出毛状白根，20～25d不定根出齐。培养至第30d，统计分析诱导生根情况，结果见表4。有2个激素组的生根率达到100%，但以NAA 1.0mg／L＋6-BA 0.2mg／L组的诱导生根效果最好，根系较发达、健壮。

表4 植物激素对百合不定芽诱导生根的影响

3 讨论

笔者前期以卷丹的鳞片为外植体，研究了植物激素对不定芽分化发生、继代增殖以及诱导生根的影响［6］。在此基础上，本文进一步探讨了卷丹的茎尖离体培养基本条件。将茎尖分化实验分为热处理和未热处理两组，结果表明，两组皆以6-BA 1.0mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素组合对于不定芽的分化发生为优；鳞茎的热处理对于茎尖的成活和芽分化表现出一定程度的负影响，但总体上与未热处理组的差异并不显著。不定芽的继代增殖培养，以6-BA 0.5mg／L＋NAA 0.2mg／L的激素组合最佳，芽增殖系数为4.20，芽增殖率达320%。芽诱导生根实验中，以6-BA 0.2mg／L＋NAA 1.0mg／L组的诱导生根效果最好，根数较多，且根系健壮。

植物茎尖培养是一项成熟的现代生物技术，已成功应用于多种植物的脱毒苗规模化生产。侵入植物的病毒一般需要通过维管组织进行转移，但茎尖分生组织尚未形成维管束，几乎不含或很少含有病毒，因此，剥取茎尖无毒生长点进行离体培养和扩繁，便可能获得大量的脱毒苗。茎尖成活率和再生苗的脱毒率，可作为衡量茎尖培养是否成功的重要指标。

研究表明，一定的高温处理能将病毒钝化，使其失去活性；但单纯对植物材料进行热处理，脱毒率较低。将热处理与茎尖培养相结合，则可大大提高脱毒效率。本实验先对食用百合的鳞茎外植体分为热处理和未热处理两种预处理，然后再进行茎尖培养比较试验，目的是探讨在两种预处理情况下的茎尖成活与分化情况以及脱毒效果的差异。关于两组试验再生苗的脱毒效果如何，将另作分析报道。

建立百合脱毒种苗生产技术体系和繁育基地，对于促进百合产业的健康发展具有重要现实意义。然而，百合的脱毒种球生产供应并不那样简单。从脱毒苗繁育，到种苗移栽和种球繁殖，再到种球的后期加工贮藏，需要形成完整配套的生产技术体系和标准，而且还涉及生产管理模式和成本控制等一系列基础环节［7］。在国内，关于百合的脱毒快繁已有不少相关研究报道［8-10］，从现实情况看，要将这些研究成果应用于生产，真正形成自己的技术体系，建立完善的生产基地，还有相当多的问题需要加以解决。

［1］赵祥云，王树栋，陈新霞，等.百合［M］.北京：中国农业出版社，2000.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［Z］.北京：化学工业出版社，2005.

［3］储成虎，武丽，许自文，等.皖西大别山区食用百合无公害高 产 栽 培 技 术 ［J］.安 徽 农 业 科 学，2005，33（11）：2068-2069.

［4］邓余良，彭慧，金鑫.皖西山区卷丹病害流行原因及其防治技术［J］.中国植保导刊，2006，（9）：28-28，21.

［5］张建华，庄天明，陈银华.百合无病毒苗快速繁殖技术［J］.上海交通大学学报，2006，24（4）：370-373.

［6］张传海，葛自兵，白雪峰，等.食用百合卷丹离体培养再生体系的建立［J］.皖西学院学报，2012，28（2）：1-3，6.

［7］熊丽，王祥宁，张艺萍，等.百合种球国产化的回顾及发展商榷［J］.西南农业学报，2008，21（3）：859-862.

［8］张艺萍，屈云慧，王祥宁，等.提高百合茎尖组织培养脱毒效率研究［J］.广东农业科学，2007，（1）：37-38.

［9］朱旭东，田松青，成海钟，等.东方百合茎尖组培技术研究［J］.安徽农业科学，2009，37（5）：1922-1923，1962.

［10］王丽花，王继华，瞿素萍，等.百合病毒脱毒及检测技术研究进展［J］.广西农业科学，2007，38（6）：673-676.