人脂肪间充质干细胞体外培养鉴定与诱导分化的初步研究＊

郭常敏，王达利，魏在荣，龙 艳

(遵义医学院烧伤整形外科，贵州遵义 563099)

软组织损伤、骨折、软骨缺损等是外科常见病多发病，损伤修复与重建、骨折、软骨的再生与治疗也是外科棘手问题，自体脂肪移植也是目前美容外科较好的方式之一。骨髓来源的间充质干细胞(BMSC)是较早发现并应用于临床的成体干细胞之一［1］，近年来通过对不同来源成体干细胞的研究和探索，有了进一步的发展，干细胞的应用逐渐广泛［2］，但仍然存在多方面的不足，如来源有限，获取困难等，不能很好的解决、应用于临床问题，而脂肪间充质干细胞来源方便，可以是肥胖病人抽脂所得，也可以是外科手术中剩余的脂肪标本，总之来源方便，获取量多，且自体移植，避免了免疫排斥反应。目前多数学者对其定向诱导分化的研究局限于前3代细胞，多次传代后是否能保持良好的生物学特性还需要进一步明确。本文通过分离培养 ADSCs，并对P9进行定向诱导分化，证明P9仍保持良好干性，在特定微环境下可以定向诱导分化。经过多次传代以后，可以提供充足的ADSCs，这就解决了干细胞来源相对不足的问题，只要少量的干细胞经过多次传代即可满足临床需求，为组织工程提供了很好的种子细胞来源。

1 材料与方法

1.1 标本来源及制备 标本来源于遵义医学院整形外科手术病人剩余的脂肪组织，女性，28岁，无全身系统疾病，经患者知情同意，留取手术中剩余脂肪组织备用。

1.2 主要的仪器和试剂 CO2培养箱(Thermo Forma，USA)，流 式 细 胞 仪 (FACSCalibur，BD，USA)，流式结果分析软件CellQuest(USA)，超纯水制备系统(MILLI－Q Biocel，MILLIPORE，USA)，倒置相差显微镜(Olympus，Japan)，高速低温离心机(Centrifuge 5804R，Eppendorf，Germany)，恒温水浴摇床 (SBD 50，Heto，Denmark)，－ 80℃ 冰 箱(JOUAN Nordic，Denmark)，正压过滤器(Millipore，USA)，分散酶(Gibco，USA)，Ⅰ型胶原酶 (Gibco，USA)，0.125%胰蛋白酶(Gibco，USA)，L － DMEM培养液 (Gibco，USA)，胎牛血清 (FBS，Gibco，USA)，小鼠抗人角蛋白19单克隆即用型抗体(Anti－ CK19 antibody，Gene Tech，中国)，小鼠抗人波形蛋白单克隆即用型抗体(Anti－vimentin antibody，Gene Tech，中国)，小鼠抗人单克隆荧光标记抗体CD105－PerCP Cy5.5、CD44－PE、CD90－FITC、CD73－APC、CD34+45+11b+19+DR －PE(BD，USA)，二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒(Gene Tech，中国)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Peprotech，USA)，人间充质干细胞成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导培养基(Cyagen，中国)。

1.3 ADSCs分离和培养 严格无菌条件下，在超净工作台内将外科手术切除新鲜脂肪组织5 g左右，用含1%双抗(PS)的D－PBS洗涤3次，用眼科剪眼科镊仔细剥离并弃除组织中的血管及筋膜，在培养皿中将脂肪肪组织剪成糊状后移入无菌青霉素瓶，加入2倍体积的1 mg/mL的Ⅰ型胶原酶37℃条件下，消化约1 h后加入等体积完全培养基(含10%胎牛血清的L－DMEM培养液、1%L－谷氨酰胺、1%PS)终止消化。200目孔径的钢网过滤收集细胞滤液，1 500 rpm离心12 min，弃上清后用完全培养液重悬细胞，接种于25 cm2细胞培养瓶，置于37℃，5%CO2饱和湿度条件下的孵箱内培养，24 h后观察更换含5 ng/mL bFGF的培养基。待原代细胞融合度达90%左右时，用含1%PS的D－PBS洗涤 2次，加入 0.125%胰蛋白酶 －0.02%EDTA 37℃消化30～60 s，倒置相差显微镜下观察待胞质回缩后用完全培养基终止消化，收集细胞，1 200 rpm离心5 min，弃上清，用含bFGF的培养基重悬细胞，以1∶2的比例传代，置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下孵箱内培养，每2～3 d换液一次，细胞融合80% ～90%传代。

1.4 观察细胞形态，检测增殖活力，计算倍增时间和扩增倍数 原代细胞培养24h后观察其贴壁情况。取第3代生长状态良好的贴壁细胞胰蛋白酶消化收集细胞，1 200 rpm离心6 min，完全培养基重悬细胞，调整密度为2×104/mL接种于24孔板中，次日每天消化3孔，细胞计数，倒置相差显微镜下计数3次，取平均值，以后每天消化3孔计数，8 d后根据细胞增殖情况绘制细胞曲线。期间每2～3 d换液一次。根据Td=T×［lg2/lg(Nt/N0)计算细胞倍增时间，T代表生长曲线中的指数增殖时间段，N0是接种时的细胞数，Nt是指数增殖末期的细胞数。根据Nt/N0计算细胞扩增倍数。

1.5 免疫细胞化学检测CK19、波形蛋白的表达取第3代贴壁细胞胰酶消化后，1 200 rpm离心6 min，完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为2×104/mL接种于小培养皿中，待细胞生长到75%左右PBS冲洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次×3 min;滴加0.3%Triton－X100湿盒内室温孵育20 min，PBS冲洗3次×3 min;室温下封闭液封闭30 min;滴加一抗(小鼠抗人的单克隆抗体CK19、波形蛋白，空白对照组用PBS替代，4℃过夜。次日(16～17 h后)复温，PBS冲洗3次 ×3 min;滴加生物素标记的二抗(兔抗鼠IgG)，37℃孵育30 min，PBS洗3次;3－二氨基联苯胺(DAB)显色10 s，自来水冲洗终止反应，苏木素复染1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片，观察结果并拍照。

1.6 流式细胞仪检测细胞表面标志 取第9代贴壁细胞，消化，离心，D－PBS重悬并调整细胞密度约为2.4×106/mL;取细胞悬液100μL加入3μL/8μL不同的荧光标记单克隆抗(CD105－PerCP Cy5.5、CD44 － PE、CD90 － FITC、CD73 － APC、CD34+45+11b+19+DR－PE)和同型阴性对照小鼠单克隆抗体振荡混匀，室温避光孵育20 min。每管加入2 mL含1%NaN3的PBS，混匀，1 000 rpm离心5 min，弃上清，振荡重悬细胞。每管加入200 μL含0.1%多聚甲醛的PBS溶液，混匀固定，4℃冰箱放置，待上流式细胞仪检测。

1.7 体外定向诱导分化能力检测 收集第8代细胞，参照诱导培养基说明书，制备诱导培养基和细胞悬液，按说明书参照浓度接种于6孔培养板中，进行如下分化诱导鉴定。

1.7.1 向成脂肪细胞诱导分化 细胞接种后每3 d换液一次，待细胞生长融合至80% ～90%，吸取完全培养基，每孔加入2 mL成脂分化诱导培养基A(成脂分化诱导基础培养基A 175 mL+FBS 20 mL+青链霉素(penicillin－streptomyc)2 mL+谷氨酰胺(Glutamine)2 mL+胰岛素(Insulin)200(L+IBMX200(L+吲哚美辛(Rosiglitazone)200(L+地塞米松(Dexamethasone)200(L)诱导培养3 d后，吸出培养基A，加入2 mL成脂诱导分化培养基B(成脂分化诱导基础培养基 B 175 mL+FBS 20 mL，penicillin－streptomyc 2 mL+Glutamine 2 mL+Insulin 200(L)，24 h后再换回成脂诱导分化培养基A液，如此循环5次即诱导完成，吸出诱导培养基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，油红O染色30 min，镜检、拍照。

1.7.2 向成骨细胞诱导分化 细胞接种后每3 d换液一次，待细胞生长融合至80% ～90%，吸掉培养基，每孔加入2 mL成骨诱导培养基(成骨分化诱导基础培养基175 mL+FBS 20 mL+penicillinstreptomyc 2 mL+Glutamine 2 mL+抗坏血酸(A-scorbate)400(L+(－甘油磷酸钠(Glycerophosphate)2 mL+Dexamethasone 20(L)，每3 d换一次液。常规诱导21 d后弃培养基，PBS清洗2次，加入2 mL 4%中性甲醛固定30 min，茜素红染色5 min，镜检、拍照。

1.7.3 向成软骨细胞诱导分化 细胞接种后离心1 000 rpm×6 min，离心后注意保持细胞团不被打散，置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中，3 d换一次成软骨诱导培养液(基础培养基194 mL+A-scorbate 600(L+Dexamethasone 20(L+Sodium Pyruvate 200(L+Proline200(L+TGF－(32 mL+ITS supplement 2 mL+1%TGF－(3)，换液时轻弹离心管壁使细胞团块脱壁悬浮，每次换液加诱导培养基1mL。常规诱导3 wk后弃培养基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，石蜡包埋切片，脱蜡蒸馏水冲洗。阿利辛蓝染色液浸染30 min，终止染色、镜检、拍照。

2 结果

2.1 ADSCs形态及生长特点及增殖活力、倍增时间和扩增倍数 原代细胞培养24 h后首次观察，细胞形态不规则，呈梭型或多角形、排列紊乱，集落样生长。原代细胞生长较慢，7～8 d首次传代，传代后细胞增殖速度明显增加，3～4 d即生长融合至85% ～90%，连续多次传代后，细胞形态较为均一，多以梭形为主，呈放射状、漩涡状排列生长。传至8代细胞仍呈梭形，立体感好。细胞计数显示第1～2天生长缓慢，第3～5天进入对数期，第7～8天生长缓慢，进入平台期(见图1)。第3代细胞倍增时间约为51.6 h，扩增倍数为2.62倍。

图1 ADSCsP3生长曲线(细胞数×104)

2.2 CK19、波形蛋白(vimentin)的表达 免疫细胞化学结果显示:该细胞不表达上皮细胞标志物CK19，间充质细胞标志物vimentin阳性表达，对照组结果呈阴性(见图2)。

2.3 流式细胞学检测ADSC细胞表面标志表达流式细胞学检测结果显示，第9代ADSC细胞CD105、CD90、CD44、CD73 分 别 为 91.25%，96.43%，99.69%，99.86%，CD45+34+11b+19+DR为0.43%(见图3)。

图2 ADSCs CK19及vimentin的表达(×100倍)

2.4 体外向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化 脂肪细胞诱导液加入9d后，细胞体积增大，胞质中有小的圆形、透亮的脂滴出现，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增多，体积增大，由原来的梭形变为圆形，互相融合，折光性增强。第17天见较多脂滴且环状排列，停止诱导，油红O染色见阳性(见图4 A)。成骨诱导10 d左右细胞外基质见有少量黑色组织沉积，似钙盐沉积，14 d左右见有圆形较明显钙结节形成，随着诱导时间的延长，黑色钙盐沉积增加，待诱导分化21 d后进行茜素红S染色，可见细胞外基质的钙盐被染成红色(见图4 B)。软骨诱导剂诱导培养后，见细胞团块逐渐增大，待诱导21 d后阿利辛蓝染色呈阳性(见图4 C)。

图3 ADSCs流式细胞检测

图4 ADSCs体外诱导分化结果

3 讨论

随着干细胞的广泛应用，继胚胎干细胞之后，骨髓间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞等成体干细胞已成为组织工程学、创伤医学、再生医学、遗传医学等多种学科的研究热点。自 Zuk等［3］2001年提出ADSC的的概念以来，脂肪间充质干细胞因其比 BMSC产量更多、分离更方便、来源更广泛［4］的优点而成为研究热点之一。ADSCs体外定向诱导可以向脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨细胞、神经元细胞等方向分化［5］，因此在再生医学及组织工程学领域中有着重要的应用价值。目前ADSCs的培养多数局限于前3代，本实验对第9代ADSCs的生物学特性进行了初步研究，初步表明本分离、培养方法可能有望弥补ADSCs产量不足的问题，即可能只要5g左右脂肪，ADSCs即可以获得大量增殖。原代细胞贴壁融合90%，可获得0.8×106～1×106个细胞，经传至第9代，可获得约2×108个细胞，足够作为一名患者移植治疗的细胞数量。

本实验通过机械分离联合酶消化法分离、提取ADSCs。经过体外培养、传代纯化，取第3代贴壁细胞检测表皮细胞特异性标志CK19和间充质细胞特异性蛋白波形蛋白。波形蛋白是一种间充质来源的所有细胞骨架成份和特异性标志。本实验分离的细胞阳性表达波形蛋白，阴性表达CK19，可以证明实验所用细胞确实来源于间质。

间充质干细胞(MSC)因特异性阳性表达而不表达或低表达造血干细胞表面标志物CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、CD19 或 HLA － DR［6］，本实验依据该标准对第9代ADSC进行了检测，结果高表达 CD105、CD73、CD90，不表达(或低表达)CD34、CD45、11b、CD19、HLA － DR，符合 2006 年国际细胞治疗协会(ISCT)MSC检测指标CD45的表达率＜2%［7］相吻合，即满足间质干细胞特异性表面分子的要求，排除了造血干细胞来源的可能。

本实验对P9 ADSCs进行定向分化诱导，向成脂方向诱导21 d后油红O染色阳性;向成骨方向诱导21 d后茜素红S染色，可见细胞外基质的钙盐被染成红色;向成软骨方向诱导21 d后进行固定、包埋、切片、脱蜡，阿利新兰特异性染成蓝色，说明ADSCs经诱导分化为成脂、成骨和成软骨细胞。可见P9 ADSCs仍然具有多向分化的能力，保持良好的干细胞多向分化潜能。且纯度高，性质稳定，则可由少量细胞经传代扩增，获取足够数量的种子细胞，解决了干细胞来源相对不足的问题，为组织工程、修复重建科学及其他医学学科提供了良好的种子细胞。

［1］毕薇薇，李超，宋广赜．人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性［J］．中国组织工程研究与临床康复，2011，15(40):7493 －7496．

［2］Phinney D G，Prockop D J．Concise review:mesenchymal stem/multipotent stromal cells:the state of transdifferentiation and modes of tissue repair－ － current views［J］．Stem Cells，2007，25(11):2896 －2902．

［3］Zuk P A，Zhu M，M izunoH，et al，Multilineage cells from hum an adipose tissue:implication for cell－based therap ies［J］．T issue Eng，2001，7(2):211 －228．

［4］JurgensW J，Oedayrajsingh － Varm aM J，H elderMN，et al．Effect of tissue － harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue:implications for cell－based therapies［J］．Cell Tissue Res，2008，332(3):415 －426．

［5］高华，王玉玲，姚亚妮，等，脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化研究［J］．中国全科学，2011，14(5B):1568－1570．

［6］Gimble J M，Guilak F．Adipose－ derived adult stem cells:isolation，characterization，and differentiation potential［J］．Cytotherapy，2003，5:362 －369．

［7］Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al．Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells．The International Society for Cellular Therapy position statement［J］．Cytotherapy，2006，8(4):315 －317．