人精子膜抗原的提取及分析

汤兴丽，王 萍

(皖南医学院 微生物学与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002)

研究表明，人类精子膜抗原能影响精子的受精功能和胚胎的发育，与生育密切相关［1］，精子膜抗原的研究有利于生殖免疫，生殖生理，以及免疫不孕和免疫避孕的研究。精子膜抗原的提取是上述研究的基础。提取精子膜抗原的方法有很多种，本实验室主要选用尿素裂解液和TDOC裂解液提取了精子膜抗原，同时进行SDS-PAGE分析比较，为进一步应用精子膜抗原检测精子抗体的研究提供物质基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 精液 来源于皖南医学院生育与不孕不育研究所，参照WHO正常标准［2］，选用新鲜液化的精液样本，精子密度≥20×109/L，活率≥70%，活力良好，精液量≥2 ml，pH 7.2 ～7.8，精浆及血清抗精子抗体(AsAb)阴性。

1.1.2 主要试剂 二硫苏糖醇(DTT)为Merck公司产品，Triton X-100为SIGMA公司产品，脱氧胆酸钠(DOC)为上海蓝季科技公司产品，苯甲磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、四甲基乙烯二胺(TEMED)、2×SDS还原性样品缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均为BOSTER公司产品，过硫酸铵(APS)为国药集团化剂公司产品，考马斯亮蓝R-250购自合肥安启公司，蛋白质marker为Fermentas产品。

1.1.3 EPS300垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)，TGL 16M高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)，uV-7502 PC紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 尿素裂解液提取法［3］将4份新鲜液化的精液混合，加等量生理盐水，1 500 r/min离心10 min，重复3次，上清收集为精浆，留取沉淀加2 ml尿素裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，100 mmol/L DTT)，然后加 100 mmol/L PMSF 40 μl，于4℃冰箱放置1 h后12 000 r/min 4℃离心10 min，收集上清分装，－20℃保存备用。

1.2.2 TDOC裂解液提取法 将4份新鲜液化的精液混合，加等量生理盐水，1 500 r/min离心10 min，重复3次，取精子沉淀加2 ml TDOC缓冲液(1%Triton X-100，10 g/L DOC，0.05 mol/L NaCl，0.02 mol/L Tris，)，然后加 100 mmol/L PMSF 40 μl，4℃冰箱放置1 h，然后12 000 r/min 4℃离心10 min，收集上清分装，－20℃保存备用。

1.2.3 上样缓冲液处理 所提抗原按1∶1与2×SDS还原性样品缓冲液混匀，100℃ 5 min，处理好的样品可置4℃冰箱备用。

1.2.4 BCA法检测蛋白浓度 按BCA蛋白浓度测定试剂盒操作步骤进行，用uV-7502PC紫外可见分光光度计测定蛋白浓度。

1.2.5 SDS-PAGE分析 分离胶12%(30%丙烯酰胺 4 ml，去离子水 3.3 ml，1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 2.5 ml，10%SDS 100 μl，10%APS 100 μl，TEMED 5 μl)浓缩胶 5%(30% 丙烯酰胺 0.4 ml，去离子水 1.7 ml，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl 0.3 ml，10%SDS 25 μl，10%APS 25 μl，TEMED 3 μl)，每孔加样品及标准蛋白均12 μl，浓缩胶电压90 V，分离胶电压140 V。分离胶用考马斯亮蓝R250染色1.5 h，脱色过夜，直至显示清晰电泳图谱，根据蛋白质marker测定蛋白质分子量。

2 结果

2.1 所提蛋白质的浓度测定结果 TDOC裂解液法﹑尿素裂解液法提取的蛋白质浓度分别为1.35 mg/ml，970 mg/ml，精浆蛋白质浓度为 39.2 mg/ml。

2.2 SDS-PAGE结果 SDS-PAGE分析显示TDOC裂解液提取的蛋白接近100 ku处较聚集，尿素裂解液提取的蛋白共有18条带，分子质量主要在130 ku以下，蛋白条带多而细，130～100 ku一条带，100～70 ku三条带，70～55 ku四条带，55～40 ku四条带，40～35 ku两条带，35～25 ku两条带，25～15 ku两条带，其中主要条带为130～100 ku，70～55 ku，55 ～40 ku，25 ku，25 ～15 ku(见图1)。

2.3 与精浆抗原对比结果 精浆抗原同时进行了SDS-PAGE分析，显示有6条蛋白聚集带，依次为170 ～130 ku，100 ～70 ku，70 ku，55 ～40 ku，40 ku，35 ku。对比可见尿素裂解液提取的蛋白明显多于TDOC裂解液提取的蛋白，主要的蛋白条带与精浆抗原不同。

3 讨论

精子含有多种抗原，结构复杂，种类繁多，按抗原的分布部位，可分为精子膜抗原，核抗原和顶体抗原［4］。精子抗原特别是膜抗原涉及精子获能、精卵识别、顶体反应、穿过透明带、精卵融合等多方面，是精子发生、成熟过程的重要标志分子，与受精和胚胎的早期发育关系密切［5］。在某些情况下如发生生殖感染、创伤和阻塞导致生殖道免疫屏障破坏、免疫抑制物质缺失时，精子膜抗原可诱发机体产生抗体，影响精子的受精能力，从而导致免疫性的不孕不育或流产等情况的发生［6］。深入研究精子膜抗原揭示受精过程和不育机制，有助于研究相关抗体及研发相关避孕疫苗，提高生育质量。

图1 SDS-PAGE分析结果1.蛋白质marker;2.TDOC裂解液法提取物;3.精浆蛋白质;4.尿素裂解液法提取物Fig 1 Results of SDS-PAGE determination1.Protein marker;2.The extracts by TDOC lysis buffer;3.Seminal plasma protein;4.The extracts by urea lysis buffer

提取精子膜抗原的方法有很多种，传统的方法有反复冻融法、超声震荡裂解法等［7］，现在不常使用。本次试验收集新鲜的精液样本采用两种裂解液提取精子膜抗原，TDOC裂解液中Triton X-100和DOC能大量结合膜脂深层的蛋白质，提取的蛋白主要为精子膜抗原［8］。尿素裂解液中DTT是一种很强的还原剂，还原蛋白质中的二硫键，阻止蛋白质中的半胱氨酸之间形成蛋白质分子内或分子间二硫键，破坏蛋白质高级结构，使之变性释放，硫脲则能增加蛋白的溶解能力，使蛋白质大量释放，苯甲磺酰氟能抑制酶对蛋白质的破坏［9］，经过裂解液处理后选择在4℃，12 000 r/min离心10 min，可有效防止蛋白降解流失。结果SDS-PAGE显示TDOC裂解液提取的蛋白仅一处聚集带，不同于沙国柱等［7］人的报道，可能是在裂解蛋白的同时导致了部分蛋白尤其是小分子蛋白的降解［10］。尿素裂解法提取的蛋白较多，且方法简便，为抗精子抗体的进一步研究提供条件。

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