四种沙棘枝叶总黄酮含量的比较研究

秦 莉，程文杰，王军扬，潘晓亮*

(1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.新疆生产建设兵团农九师170团，新疆 塔城 834615)

沙棘(Hippophaerhamnoides)，别名酸刺、醋柳，属胡颓子科落叶灌木或小乔木，喜光照，是一种药食兼用的多年生植株。广泛分布于我国，据统计，2010年中国有沙棘林140×104hm2，占世界沙棘总面积的90%以上。其中“三北”地区有117×104hm2，占全国总面积的84%[1]。随着新疆自治区以防风固沙为主的退耕还林、还草工程的实施，沙棘将在这项工程中发挥巨大作用，种植面积将逐年增加。

黄酮类化合物是一类在植物界广泛存在的多酚类天然产物。从沙棘果和叶中提取的总黄酮具有抗心肌缺血、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、具有抵御紫外线、抗辐射、抗肿瘤、抗氧化、抗艾滋病毒(HIV)和增强免疫力等广泛的药理作用[2-4]。

沙棘含有丰富的黄酮类化合物，具有抗氧化和清除自由基；抗肿瘤、抗癌症；抗菌抗病毒；抗炎免疫等功效[5]。施荣富等[6]相关文献报道，沙棘叶中含有丰富的黄酮类化合物成分，并且与沙棘果中的成分不相同。异鼠李素和槲皮素主要分布在沙棘果中，并且所占比例约为70%，而叶中除了异鼠李素、槲皮素之外，还有含量比较高的山奈酚。品种不同，叶中所含的黄酮类化合物种类的含量分布也不同，如中国沙棘中，山奈酚、异鼠李素、槲皮素三者所占总含量的比例非常相近。沙棘果实中黄酮含量为309～945 mg/100 g，而叶中黄酮的含量高于果实，为310～1 238 mg/100g[7]。目前沙棘黄酮类化合物的研究主要集中于果实、果渣、果皮及叶四种材料，除此之外的地上部分多是被废弃处置，未被利用，因此对沙棘其他部位黄酮含量的测定进行研究具有必要性。本文通过超声波技术对不同品种同一部位及同一品种不同部位的沙棘枝叶进行黄酮类化合物的提取，采用紫外分光光度法测定其总黄酮的含量，以期为人们进一步利用沙棘资源提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料 小果沙棘、中果沙棘、大果沙棘、雄性沙棘4个品种的沙棘叶、小枝(0

1.1.2 主要仪器及试剂 UV-1 100 LabTech紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)，KQ-50R型超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司)，万分之一电子天平，台式高速离心机。

芦丁(Rutin)标准品(纯度大于98%，批号：090708)购于上海融禾医药科技发展有限公司；甲醇、氢氧化钾、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇均为分析纯；试验过程中使用的水均为双蒸水。

1.2 试验方法

试验采用紫外分光光度法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法)测定总黄酮含量。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法是普遍用于测定中药材、成方制剂中总黄酮类化合物含量的方法[8]。其原理是NaNO2先将黄酮类化合物还原，铝离子与黄酮类化合物在碱性条件下生成红色络合物，红色络合物在一定波长范围内具有光吸收，通过测定其吸光度从而确定总黄酮的含量[9]。

1.2.1 沙棘枝叶的预处理 4个品种的沙棘叶、小枝、中枝、大杆及其混合株65 ℃烘至恒重，粉碎，过60目筛，密封，备用。

1.2.2 芦丁标准品溶液的制备 称取105 ℃下干燥至恒重的芦丁对照品0.1 g于100 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液，浓度为1 mg/mL。

1.2.3 总黄酮的提取 总黄酮的提取参考冯薇等[10]方法略有改动。精密称取样品粉末0.2 g，置于10 mL离心管中，加入5 mL甲醇，称重，超声提取70 min，然后5 000 r/min离心15 min，上清液即为总黄酮提取液，备测。每个样品重复提取3次。

1.2.4 最大吸收波长的选择 取对照品溶液1.0 mL于25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，以甲醇作空白对照，在200～600 nm波长范围内进行紫外可见扫描，结果显示，芦丁溶液在460 nm处具有最佳吸收峰，故选择460 nm作为吸收波长。

1.2.5 标准曲线的绘制 精确吸取芦丁标准对照液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL于25 mL 容量瓶中，分别加1%NaNO2溶液3 mL，摇匀，静置6 min，加1%Al(NO3)3溶液3 mL，摇匀，静置6 min，加1%NaOH溶液4 mL，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15 min，得对照品待测液。以相应溶液做空白，在460 nm波长处读取吸光度。以吸光度(A)做y轴，以浓度(C)做x轴，获取标准曲线：y=11.031x-0.0379，R2=0.9983，如图1所示。

图1 芦丁标准品浓度-吸光度标准曲线Fig.1 Standard Rutin solution curve of concentration-absorbance

1.2.6 方法学考察 分别精确量取0.75 mL芦丁标准品溶液液5份，按绘制标准曲线的方法，测定吸光度值，分析可得SD为0.1673%，RSD为0.6%，所测结果较小，表明试验重复性比较好，所测数据较准确。试验结果见表1。

表1 芦丁标准品重现性试验结果Table 1 The results of repetition of the standard Rutin solution

1.2.7 样品黄酮含量的测定 精确吸取样品提取液250 μL，置于10 mL离心管中，分别加1%NaNO2溶液0.6 mL，摇匀，静置6 min，加1%Al(NO3)3溶溶液0.6 mL，摇匀，静置6 min，加1%NaOH溶液2.0 mL，加60%乙醇稀释至5 mL，摇匀，静置15 min，在460 nm波长处读取吸光度，由标准曲线计算其浓度。

1.2.8 数据处理 采用Excel数据，后采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 同一品种不同部位总黄酮含量的比较

由表2可知，小果沙棘、中果沙棘、大果沙棘不同部位总黄酮含量均以枝叶混合的最高，依次为(9.3009±0.1672) mg/g、(10.3175±0.0103) mg/g、(11.3093±0.2701) mg/g；其次为叶，依次为：(8.3750±0.1108) mg/g、(9.5835±0.0123) mg/g、(11.0546±0.0572) mg/g；大杆的含量最低，依次为：(5.0520±0.012) mg/g、(5.4330±0.012) mg/g、(6.9774±0.3275) mg/g。

由表2知，小果沙棘除小枝和中枝总黄酮含量差异不显著外(P>0.05)，其他部位之间总黄酮含量均具有显著性差异(P<0.05)。中果沙棘中将叶、小枝、中枝、枝叶混合四个不同部分进行两两比较，结果显示，均差异不显著(P>0.05)。但将大杆与其他四部分进行两两比较，结果显示，均具有显著性差异(P<0.05)。大果沙棘中将大果的叶与枝叶进行两两比较，两者差异不显著(P>0.05)；小枝与中枝两两比较，也差异不显著(P>0.05)；除此之外其他部位进行两两比较均具有显著性差异(P<0.05)。雄性沙棘中将其叶与枝叶混合两部分进行比较，结果显示两者差异不显著(P>0.05)；中枝、大杆两部分进行比较，结果显示差异不著(P>0.05)；除此之外其他部位进行两两比较均具有显著性差异(P<0.05)。

2.2 不同品种同一部位总黄酮含量的比较

由表2可知，不同品种同一部位总黄酮含量有所不同。叶所含总黄酮含量大小依次为：雄性沙棘>大果沙棘>中果沙棘>小果沙棘。除大果和雄性比较差异不显外(P>0.05)，其他部位之间进行比较均具有显著性差异(P<0.05)；小枝所含黄酮含量大小依次为中果沙棘>雄性沙棘>大果沙棘>小果沙棘，其中中果沙棘与雄性沙棘比较差异不显著(P>0.05)，大果沙棘与雄性沙棘比较差异不显著(P>0.05)，其他部位之间进行比较均具有显著性差异(P<0.05)；中枝所含黄酮含量大小依次为：雄性沙棘>大果沙棘>中果沙棘>小果沙棘，其中中果沙棘与大果沙棘比较差异不显著(P>0.05)，大果沙棘与雄性沙棘比较差异不显著(P>0.05)，其他部位之间进行比较均具有显著性差异(P<0.05)。大杆所含黄酮含量大小依次为：雄性沙棘>大果沙棘>中果沙棘>小果沙棘，不同部位之间进行比较均具有显著性差异(P<0.05)；枝叶混合所含黄酮含量大小依次为：大果沙棘>雄性沙棘>中果沙棘>小果沙棘，不同部位之间进行比较结果显示差异不显著(P>0.05)。

表2 四种沙棘不同部位总黄酮含量的比较Table 2 Comparison of total flavonoids content in different parts of four Hippophae rhamnoides (mg/g)

注：S：样品编号；1.小果沙棘；2.中果沙棘；3.大果沙棘；4.雄性沙棘；图中数据为平均值±标准误; 同行肩标相同小写字母者表示同一品种不同部位之间在0.05水平上差异不显著；同列肩标相同大写字母者表示不同品种同一部位之间在0.05水平上差异不显著。

Note：S.sample number；1.Small fruit Hippophae rhamnoides；2.Middle fruit Hippophae rhamnoides；3.Big fruit Hippophae rhamnoides；4.Infertility Hippophae rhamnoides；Data in the table are mean±standard error;values with same lowercase superscripts mean no significant at level 0.05 at different parts of the same variety;Values with same capital letter superscripts indicate insignificant difference at 0.05 level at the same parts of different varieties.

3 讨 论

本试验用以芦丁做标准品所测叶中总黄酮含量范围为8～12 mg/g，所测数据与施荣福等[6]、郑京[11]及李垚等[12]关于沙棘叶中所含总黄酮含量的报道相一致。表明紫外分光光度法法具有操作简单、成本低、分析快、重现性好、结果准确等优点。

本试验对同一品种不同部位黄酮含量进行分析，发现枝叶中的黄酮含量均高于其他部位，总体表现为：枝叶>叶>小枝>中枝>大杆，这与不同种类植物体内总黄酮含量的分布状况相似[13-15]，而雄性沙棘的总黄酮含量则是在叶部较高，表现为：叶>枝叶>小枝>中枝>大杆；对不同品种同一部位进行黄酮含量的测定，结果表明雄性沙棘的叶、中枝、大杆含量较其他品种较高。相关研究表明，黄酮类物质是植物经过光合作用产生的一大类化合物[16]，起始于苯丙烷代谢途径[17]。叶是植物主要的光合器官，由此推断叶可能是产生黄酮类物质的主要器官。以上结果，可能由叶进行光合作用合成黄酮类化合物，其中一部分在叶中积累，另一部分由茎转运至果实、水平根茎、侧根和主根。

4 结 论

本试验可知，沙棘不同部位均有一定的黄酮含量，尤其以枝叶及叶中含量较高。小果沙棘、中果沙棘、大果沙棘中总黄酮含量大小依次为：枝叶>叶>小枝>中枝>大杆，而雄性沙棘各部位总黄酮含量大小依次为：叶>枝叶>小枝>中枝>大杆。本试验对其含量测定做了初步的研究，有利于沙棘枝叶的进一步开发与利用，以便充分利用天然植物资源，使其变成可被利用的宝贵资源。

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