野猪ASIP基因的突变位点及其与毛色表型的相关性研究

付冬丽，杨广礼，代燎原， 罗玉柱

(1. 甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2. 商丘师范学院 生命科学学院，河南 商丘 476000)

动物毛色遗传研究是动物表型变化遗传机理研究的最好模型[1]。目前实验小鼠内存在378个与毛色相关的遗传座位，171个毛色功能基因已经被克隆鉴别[2]。这些基因以不同路径单独或联合影响着动物色素细胞的发育、分化、增殖和迁移等过程，还影响着色素细胞分泌黑色素的合成、转运和分布，最终影响动物表型毛色和羽毛[1]。而这些基因的编码区域和调控序列引起的突变，如SNP、复制、插入和缺失，对动物的毛色变异都有可能起主要作用。动物的毛色表型性状受其体内所存在的两种黑色素前体物质：真黑色素和伪黑色素所控制[3]。Agouti基因(ASIP)编码的是一类旁分泌信号蛋白分子，作为MC1R基因的配基，来抑制MC1R的信号。它们的比率基本上受ASIP和MC1R配合受体系统控制。MCIR基因突变使其失去功能，动物的基本毛色为黄色(伪黑素占优)，而MCIR基因功能的获得或ASIP基因突变使其功能丧失，动物的毛色为黑色(真黑素占优)。

ASIP基因结构在哺乳动物内具有很高的保守性，包括鼠、人、马、猪、牛和犬[4-9]。小鼠基因组的插入或删除变异会影响ASIP及其邻近座位ASIP基因表达调控的解除，引起黄色素的沉积、成年鼠肥胖、糖尿病、肿瘤生长和胚胎的死亡[10]。其它鼠ASIP编码区和调控区域的突变影响着ASIP的表达和功能，最终影响被毛色素沉积模式[11-12]。ASIP基因变异使其功能丧失，导致动物毛色的变异已经在家养动物类群中发现，如犬属动物、猫、猪、马、老鼠和狐狸等[6，9，13-16]。同样也在野生物种，如野马和野绵羊中发现[17-18]。ASIP基因的表达在动物不同的组织部分及不同的发育时期存在很大的变异。如动物背腹部的毛色差异是由背腹部ASIP基因表达差异调控。然而，鸟类羽毛不同的毛色带是由ASIP在羽毛不同的发育时期引起[19-22]。

野猪作为家猪的祖先，其驯养过程对野猪的形态、生理和行为改变起着重要的作用[22-24]。在这些变化中，与现代家猪和育成的商品猪相比，被毛的变化似乎是最明显的一类。究其野猪和家猪之间的毛色变化的机理和原因仍然不是很清楚。因此，本研究选择被毛颜色存在差异的野猪群体，通过直接测序法识别蕴藏在这些野猪群体内影响毛色差异的ASIP候选功能基因的突变位点及群体内的多态性，结合群体遗传学理论，阐明野猪群体内及与商品猪、现代家养品种间影响毛色差异功能基因的遗传机理，以此为基础了解野猪群体遗传多样性来证明ASIP基因是否在野猪群体里面对毛色变化的调控作用。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验样品于2009年采自商丘市黄环养殖场饲养的野猪群体，选择成年个体间没有血缘关系的野猪72头，分别采取每只猪的耳组织样品约0.5 g左右，装入事先准备好含有75%的酒精溶液的EP管内保存，然后带回实验室冷藏于-20 ℃冰箱，以供基因组DNA的提取。长白猪样品于2006年采集天津宁和种猪场。72头野猪按照图1被毛颜色表型进行分类。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 采用EasyPure Genomic DNA Extraction 试剂盒提取猪耳组织基因组DNA(北京，天根生物技术有限公司)，操作过程严格按照说明书进行，提取好的DNA经琼脂糖电泳检测后保存于-20 ℃冰箱，作为PCR扩增的模板。

图1 野猪群体和长白猪的被毛表型Fig. 1 Coat color phenotype in the wild boar population and landrace

1.2.2 引物设计 通过Ensemble网站(http://www.ensembl.org/index.html)获取猪ASIP基因序列(ENSSSCT00000007962)，该序列含有ASIP基因5个外显子、4个内含子和5′侧翼区(5′-UTR)、3′-UTR区域序列，通过Primer 5引物设计软件，设计了5对包括5个外显子、5′-UTR、3′-UTR和部分内含子序列引物。所有引物由北京奥科鼎盛生物技术有限公司合成，引物名称、序列、扩增片段大小和最佳退火温度见表1。

表1 引物名称、引物序列、扩增片段大小和最佳退火温度Table 1 Primer name, primer sequence,optimal annealing temperatures(Tm) and amplicon sizes

1.2.3 SNPs的鉴别 为了有效的识别SNPs，分别选取被毛为黑色、棕黄色、银棕色的野猪个体各5头，混合成DNA池基因组，作为PCR扩增模板。PCR扩增所用反应体系为25 μL，其中含有50 ng模板DNA，ddH2O 18.5 μL，10 μmol·L-110×buffer 2.5 μL，25 mmol· L-1Mg2+1.5 μL， 10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL， 10 μmol· L-1引物各0.5 μL，2.5 U Taq酶。循环参数为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，各引物在退火温度下(表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36个循环；最后72℃延伸10 min。PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照，若出现明显的目的条带，收集PCR产物，直接送北京华大生物技术有限公司测序，然后用DNASTAR软件进行序列比对分析检测突变位点。

1.2.4 SNPs与被毛表型相关性研究 所识别的SNPs突变位点，在没有找到适宜的酶切位点情况下。重新设计引物(表1，ASIP-3′-UTR)，再次扩增、纯化及测序，用DNASTAR软件分析判定72头不同被毛表型的野猪群体和30头长白猪群体内的基因型，最后通过被毛表型记录结果分析与基因型之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 SNPs的鉴别

以野猪被毛为黑色、棕黄色、银棕色的个体各5头提取的基因组DNA，各取5 μL混合成DNA池，用表1中的引物和退火温度、材料和方法中的反应体系和循环参数进行PCR扩增，对不同被毛颜色的混合池DNA为模板扩增获得每对引物预期的片段大小。若出现明亮的目的条带(图2)，收集PCR产物，直接送北京华大生物技术有限公司测序。测序结果由DNAStar软件分析，分析结果表明，在ASIP基因的3′-UTR区域发现一个T→C的突变位点(图3)，而在其它区域没用发现。该位点在ASIP基因cDNA序列的695位(ENSSS-CT00000007962 cDNA)，因此命名为ASIPc695T→C。这个结果与一些其他哺乳动物的结果很相似。如对非洲人黑色皮肤的研究中，在ASIP基因3′-UTR发现了 g 8818的A-G突变[25]。而基因的表达可以通过mRNAs转录后3′-UTR区域里面的元件调控。

图2ASIP基因第5外显子引物PCR扩增结果
Fig. 2 Amplification results of fifth exon primer in porcineASIPgene
M.Marker DL 2000；C.对照;1-7.PCR扩增产物
M.Marker;C.Control;1-7.PCR amplification product

图3 ASIP基因3′-UTR c 695 T→C突变位点
Fig. 3 The c 695 T→C mutation site in the wild boar ASIP gene 3′-UTR

2.2 SNP突变位点基因型与被毛表型相关性

所识别的SNP突变位点，用ASIP-3′-UTR引物扩增后(图4)，通过直接测序，在72头不同被毛表型的野猪群体和30头长白猪群体内进行基因型判定，结果见表2。所有野猪个体里面出现CC或CT两种基因型，而长白猪群体里面只出现了TT基因型。等位基因C是野猪群体里面的优势等位基因。7个不同毛色类群的野猪群体里面，都存在CC和CT两种基因型，也就是说，ASIP基因3′-UTR c.695 T→C的突变，可能影响着与长白猪白色被毛不同的其他被毛表型，也有可能还有其他毛色功能基因参与野猪毛色的形成。

图 4 ASIP基因3′-UTR引物PCR扩增结果Fig.4 Amplification results of 3′-UTR primer in porcine ASIP geneM.Marker DL 2000;C.对照;1-7.PCR扩增产物M.Marker;C.Control;1-7.PCR amplification product

3 讨 论

野仔猪从出生到成年，保幼带随着仔猪的生长到6月龄时就会消失，到成年时呈现出灰色或褐色被毛。野猪长期的自然选择引起野猪群体多样性的被毛变成，包括黑色、白色、棕黄色、灰色、红棕色、黑棕色、棕黒色、银棕色、灰棕色等色素类型。在多数野猪群体内，所有的猪群享有相同的毛色模式，野生型作为品种的特征。但是，在大多数野猪群体内这种野生型的毛色也存在以上被毛颜色的变异，可能有不同的毛色功能基因调控。本研究以野猪被毛为黑色、棕黄色、银棕色的个体各5头提取的基因组DNA混合成的DNA池为PCR扩增模板，以ASIP基因的5对引物进行扩增、纯化和测序，只在ASIP基因的3′-UTR区域发现一个T→C的突变位点，而在其他区域没用发现。这个结果与一些其它哺乳动物的结果很相似。如对非洲人黑色皮肤的研究中，在ASIP基因3′-UTR发现了g.8818的A-G突变[25]。而基因的表达可以通过mRNAs转录后3′-UTR区域里面的元件调控。要确定ASIP基因3′-UTR区域里面的T→C碱基突变是否影响野猪的不同毛色类型。我们在72头不同被毛表型的野猪群体和30头长白猪群体内进行基因型判定，所有野猪个体里面出现CC和CT两种基因型，而长白猪群体里面只出现了TT基因型。等位基因C是野猪群体里面的优势等位基因。7个不同毛色类群的野猪群体里面，都存在CC和CT两种基因型，也就是说，ASIP基因3′-UTR c.695 T→C的突变，可能影响着不同与长白猪白色被毛的其他被毛表型，也有可能还有其它毛色功能基因参与野猪毛色的形成。野猪被毛颜色相比于商品猪、其他地方家猪存在的差异，所能做出的解释有如下几点：野生型动物没有经过人为的特异性选择，其次一些突变影响野生动物被毛的形成，而有些性状受到强有力的选择，或者是根据人类的爱好和需要经过选择来转变动物被毛的表型。野猪群体里面存在野生状态下的超纯选择维持着野猪的伪装被毛，也就是说某一功能基因虽然在野猪群体内存在突变，很难找到某一突变位点与其某一毛色存在强相关性。

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