基于网络药理学预测生地黄治疗银屑病的分子机制＊

姜春燕，谭 勇，吕 诚，李 立，李 健，张广中，李元文，姜 淼，韩学杰，吕爱平△

(1.首都医科大学附属北京中医医院皮肤科，北京 100010;2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700;3.北京中医药大学基础医学院人体形态学系，北京 100029;4.北京中医药大学附属东方医院皮肤科，北京 100078)

银屑病俗称牛皮癣，中医古称白疕，是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，属于皮外科的疑难杂症之一。临床实践证明，中医辨证论治银屑病能够取得良好疗效，而与西医诊治具有互补性。既往我们对银屑病的中医证候分类规律和用药规律进行了探索，发现血热证是银屑病最常见的证型，生地黄是治疗其最常用的中草药［1］。基于我们既往网络药理学研究基础［2，3］，本研究采用网络药理学分析方法，预测生地黄治疗银屑病的分子网络机制，为探索中药多靶点治疗病证的机制研究提供方法学参考。

1 材料与方法

从中华人民共和国药典(2005版)中查询生地黄的有效成分，从美国国家卫生研究所(NIH)建立的小分子生物活性数据库(http://pubchem.Ncbi.him.nih.gov)和基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)分别检索生地黄各个有效成分对应人类活性靶蛋白和银屑病相关基因(检索日期:2012年8月29日)，将上述数据导入IPA(Ingenuity Pathway Analysis)数据分析平台，运行“core analysis”进行数据分析并得到相关结果。

2 结果

2.1 生地黄靶蛋白及靶标网络

表1显示，通过检索PubChem数据库找到生地黄共有7个靶蛋白。通过IPA软件构建这些靶蛋白的相互作用网络(图1)。该网络主要展示“与癌症形成及细胞生长与死亡相关的分子”相互关系特征，提示这些靶蛋白参与癌症形成及细胞生长与死亡的调控。

表1 生地黄靶标蛋白

2.2 银屑病相关基因生物学网络及功能

表2显示，通过检索 gene数据库，共得到165个银屑病相关基因。把这些基因导入IPA软件，共能构建15个分子相互作用网络，这些分子主要涉及3个经典通路，其中涉及银屑病相关基因最多的是网络(图2)中的基因及核转录因子 κB(Nuclear Factor Kappa binding，NF-κB)信号通路(图 4)中的相关基因。图2主要展示“与皮肤炎症、结缔组织病变相关的分子”相互关系特征，提示这些基因参与皮肤炎症、结缔组织的调控。

图1 生地黄靶蛋白相互作用网络

2.3 银屑病相关基因及生地黄靶蛋白共同参与分子网络及生物学通路

在IPA系统的Comparison功能中，比较银屑病相关基因及生地黄靶蛋白共同参与的分子网络及生物学通路。图3显示，肿瘤抑制蛋白(TP53)、核转录因子 κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF)、基质金属蛋白酶-1(MMP1)及基质金属蛋白酶-2(MMP2)是银屑病和生地黄共同关联的分子，提示生地黄可能主要通过调节这些分子对银屑病发挥治疗作用。图4显示，NF-κB信号通路是银屑病相关基因及生地黄靶蛋白共同参与的生物学通路，但它们作用的靶点并不尽相同，提示生地黄靶蛋白GSK3B通过调控NF-κB信号通路对银屑病发挥治疗作用。

表2 银屑病相关主要基因

图2 银屑病相关基因分子网络

图3 “生地黄靶蛋白-银屑病相关基因”分子网络

3 讨论

蛋白质相互作用网络(Protein-protein Interaction Network)是研究生物功能或病理变化分子基础的新途径和新方法，也是目前国际上生物信息学研究的热点之一［4，5］。发现并建立与疾病相关的分子作用网络，对于认识复杂疾病至关重要，也是现代生物医学研究所面临的重大挑战［6］。网络药理学基本思路是理解疾病“表型-基因-靶点-药物”相互作用的网络特征，通过网络分析观察药物对疾病网络的干预与影响，寻找可能的组合药物靶标，预测最优化的组合药物［2］。基于网络药理学关键技术研究，对于预测药效及药理机制既是方法学创新，又具有重要的社会、经济效益［7］。许多复杂性疾病，如心血管疾病、肿瘤、糖尿病、银屑病等是由多基因、多功能蛋白相互作用紊乱而形成的疾病网络。中药具有多成分、多靶点及系统调控的网络功能特征，探索中药对疾病的调控机制与网络药理学的研究思路有许多相似之处［8］。因此，本研究采用网络药理学的研究方法探索生地黄治疗银屑病的分子机制。

图4 银屑病相关基因及生地黄靶蛋白共同参与的NF-κB信号通路

PubChem数据库和Gene数据库是由美国国立卫生研究院(NIH)建立的公共数据库［9］。通过其中丰富的化合物、生物活性信息和疾病相关基因信息，以及数据库自身对这些信息进行整合分析的功能，检索生地黄有效成分靶蛋白和银屑病相关基因作为我们构建生地黄靶标网络和银屑病疾病网络的分子基础。IPA生物分析软件能够分析、整合、理解来自于基因表达等系统生物学、组学等的实验数据，能够搜索到有关基因、蛋白质、化学品和药物的信息，并能建立起实验系统的交互模型［10］。在本研究中，我们除了利用IPA平台构建生地黄靶标网络和银屑病疾病网络，同时利用 IPA软件中Comparison Analysis的分析功能对这两个网络进行比较分析，发现二者网络的异同点以及二者生物学通路的异同点，进而寻找生地黄治疗银屑病的生物学基础。

本研究结果显示，生地黄可能主要通过调节TP53、NF-κB、TNF、MMP1 和 MMP2 五个分子，以及重组人糖原合成酶激酶3β(GSK3B)参与的 NF-κB信号通路对银屑病发挥治疗作用。TP53是调节细胞增殖与凋亡的重要蛋白［11］，能有效地调节表皮细胞的增殖周期，而银屑病皮损中P53蛋白均表达异常［12，13］，调控机制失去平衡，成为表皮增殖紊乱的重要原因［14］。肿瘤坏死因子(TNF)基因是一种既能直接杀死肿瘤细胞，又能通过激活免疫系统发挥抗肿瘤作用的细胞因子。TNF-a出现在炎症反应初期，是机体炎症与免疫反应应答的重要调节因子。TNF-α在银屑病的发病机制中有着重要作用，是银屑病炎症反应的始动因素［15，16］，参与银屑病的启动、维持和复发，且与浸润的细胞成分及角质形成细胞的增殖有关［17］。金属蛋白酶(Matrix metallo proteinase，MMPs)是一类结构中含 Zn+和 Ca2+的蛋白水解酶类，是细胞外基质和基底膜降解主要酶类之一。近年来有研究表明，MMPs是银屑病的新生血管形成的重要因素，在银屑病的发病中起重要作用［18，19］。NF-κB 是一种作用广泛的转录因子，调控众多的细胞因子和炎症介质的基因表达，调节免疫反应，参与细胞内信号传递，从而参与调节组织细胞的生理、病理反应［20，21］。免疫介导是银屑病的主要发生机制，银屑病患者皮损区一些细胞因子及黏附分子表达异常，其中包括 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α 和神经生长因子(NGF)等［22］，而这些因子编码基因的启动子或增强子上都有NF-κB的结合位点。慢性银屑病斑块中 NF-κB活化缺陷与皮损的形成有关［23］。NF-κB p65 的异常表达与银屑病的发生、发展过程密切相关［24，25］。总之，银屑病疾病位点和生地黄干预靶点都能体现在相同的分子网络和细胞信号转导通路上，干预这些分子网络和通路中的相同或不同的关键分子，进而影响整个网络或通路的生物学功能，这也许就是生地黄治疗银屑病的分子生物学机制之一。生地黄是治疗血热证银屑病最主要的中草药［1］，以药测证，可以推断上述生地黄的作用靶标，也可能反映了血热证的生物学特征。

总之，网络药理学为探索中药治疗疾证分子机制开辟了一条高通量途径，为中药有效成分筛选及探索效应机制，进而为临床用药及新药研发提供了新思路和新方法。目前网络药理学仍处于起步发展阶段，其研究手段、计算方法及应用软件还有待进一步探索，基于大量数据库和算法构建的分子网络及药物靶标网络还需进一步实验验证［26］。

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