芹菜素对U251胶质瘤细胞生长及p21、p53蛋白表达的影响

杨志英，邓志刚，伍健明，蓝伟红，张茂祥

在癌症和饮食的相关性越来越强的今天，天然抗癌食物倍受重视，芹菜素作为食物提取物也被人们广泛关注。国内外试验研究表明，芹菜素具有广谱的抗瘤性[1]，包括前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]、宫颈癌[5]、结肠癌[6]等，然而目前芹菜素对中枢神经肿瘤——胶质瘤是否具有抑制作用，却鲜见国内外报道。本研究旨在通过对体外培养的U251人胶质瘤细胞进行实验，探讨芹菜素是否对胶质瘤细胞生长及p21、p53 表达有影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 细胞系 胶质瘤细胞株 U251 购于中科院上海细胞所。

1.1.2 主要试剂 芹菜素购于美国 Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶购于美国 Amresco公司；苯甲基硫酰氟（PMSF）购于美国 Promega公司；RPMI 1640 培养基、噻唑蓝（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）购于Gibco公司；鼠单克隆抗人 p21和p53 抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国 Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物配置 胶质瘤 U251 细胞置于细胞培养箱中，RPMI 1640 培养液常规传代，取其生长对数期的细胞用于实验。100% DMSO 溶解芹菜素，配制成 40 mmol/L的浓缩液，于–20 ℃贮存备用。实验时加入完全培养基以配制浓度分别为20、40、80 μmol/L的芹菜素工作液，以完全培养基为对照组。

1.2.2 MTT 法检测芹菜素对 U251 胶质瘤细胞增殖抑制率 消化液消化 U251 胶质瘤细胞，以全培养液终止并调整细胞密度至 1×105个/L，接种于96 孔板，置于培养箱内培养 24 h。吸去旧培养液，加入终浓度为0（对照组）、20、40、80 μmol/L的芹菜素工作液，分别培养 24、48及72 h。加入新鲜配制的MTT，培养 4 h，取出，弃上清，加入 DMSO，置于摇床振荡 10 min，至颗粒完全溶解后，于酶标仪测吸光度值（A 值），测定波长为570 nm。每组设 5个平行孔，实验重复 3 次。计算细胞抑制率，公式为：细胞抑制率（%）=（A对照组－A处理组）/A对照组×100%。

1.2.3 Western blot 检测芹菜素对 U251 胶质瘤细胞 p21和p53蛋白表达的影响 U251 胶质瘤细胞分别用不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)的芹菜素工作液处理 48 h，收集细胞，3000 r/min 离心10 min 后，冰 PBS 冲洗，加入细胞裂解液，于冰上裂解 1 h 后，13000 r/min 离心 10 min，收集上清。测定蛋白含量采用 Folin-酚试剂法。加入上样缓冲液后加热使其变性，凝胶电泳以分离蛋白质。转移蛋白带至 PVDF 膜上，封闭液封闭蛋白结合位点 2 h。加入 p53、p21 一抗(按 1∶1000 倍稀释)，4 ℃ 孵育过夜。加相应辣根过氧化物酶标记的二抗(按 1∶2000 倍稀释)，室温孵育 1 h。以ECL 显色系统显色。采用 WO-9413B 型凝胶成像系统自带软件 Gelpro 32 分析胶片中的蛋白条带，以各组灰度面积的乘积/内参照（β-actin）灰度面积的乘积反映相对蛋白表达丰度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 芹菜素对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

20 μmol/L的芹菜素抑制胶质瘤 U251 细胞增殖的作用不明显（P ＞0.05），24、48、72 h的抑制率分别为3.07%±0.13%、3.98%±0.15%、4.86%±0.21%。而 40 μmol/L 及80 μmol/L的芹菜素抑制胶质瘤 U251 细胞增殖（P＜0.05），其 24、48、72 h的抑制率分别为19.12%±0.22%、28.79%±0.18%、36.53%±0.19% 及37.41%±0.16%、45.86%±0.23%、54.25%±0.24%，呈现时间和剂量依赖性，见图 1。

图1 不同浓度芹菜素对 U251 胶质瘤细胞增殖的影响Figure1 Effect of apigenin with various concentrations on proliferation of glioma cell line U251

2.2 芹菜素对胶质瘤细胞 p53和p21 表达的影响

Western blot 检测发现，芹菜素可以上调 U251胶质瘤细胞中 p53和p21蛋白的表达，且随着芹菜素浓度的增加，蛋白表达逐渐增加，结果见图 2及图 3。

图2 不同浓度芹菜素对胶质瘤细胞 p53和p21蛋白表达的影响Figure2 Effect of apigenin with various concentrations on p21, p53 protein expression in glioma cell line U251

图3 不同浓度芹菜素对胶质瘤细胞 p53和p21蛋白表达的影响Figure3 Effect of apigenin with various concentrations on p21, p53 protein expression in glioma cell line U251

3 讨论

胶质瘤是居中枢神经系统首位的恶性肿瘤，占颅内肿瘤的40% 以上，其特点是发病率高，早期诊断难，治愈率低，易复发及易死亡[7]。目前临床胶质瘤常规是采用显微手术切除、放疗和化疗为一体的治疗方案[7]。对于胶质瘤患者，尤其是高度恶性的患者，化疗在治疗中的重要性是明确并肯定的。然而，胶质瘤的不均质性，致使其对传统化疗药物不敏感，导致整体治疗效果不理想，并且毒副作用明显，患者耐受性差，预后也不理想。因此，寻找治疗胶质瘤新药，设计新的胶质瘤化疗方案具有重要的临床意义。

芹菜素，也称为芹黄素、洋芹素、芹菜配基等，是一种广泛存在于多种食用植物中的黄酮类化合物，其中以芹菜根的含量最为丰富。化学结构上3个烃基以及C2=C3双键的存在，使之拥有相对独特的药理学效应和生物学特性。其具有多种生物活性[8]，如抗病毒、抗炎症、抗突变、抗肿瘤、抗氧化、抗焦虑、保护心血管、保护中枢神经等，其中以抗肿瘤作用最为人关注。

正常细胞的增殖取决于癌基因和抑癌基因的平衡调节。p53和p21是目前关注较多的抑癌基因。p53 表达产物 p53蛋白为基因调节蛋白，具有调节细胞周期的作用。倘若 p53 基因发生突变，p53蛋白失活，细胞分裂也将失去节制，造成细胞恶变[9]。反之，如果 p53 基因稳定，p53蛋白表达水平升高，则能导致肿瘤细胞周期停滞甚至细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长[10]。而 p21 基因编码的p21蛋白为核内蛋白，同样对调控细胞生长、分化具有重要作用。p21蛋白水平的异常直接影响细胞的发展方向，也与肿瘤的发生发展具有密切的联系[11]。相关研究表明，芹菜素在体外能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖。当前已知的作用机制主要围绕以下三个方面：细胞周期阻滞[2-3]、诱导细胞凋亡[4-6]及抑制肿瘤血管的生成[12]。本研究结果显示，芹菜素在体外呈剂量及时间依赖性地抑制胶质瘤U251 细胞增殖，并能上调 U251 胶质瘤细胞中p53和p21蛋白的表达，且作用呈浓度依赖性。根据上述研究结果，我们推测，芹菜素可能通过激活 p53 途径，增加 p53的稳定性，使 U251 胶质瘤细胞内 p53和p21蛋白表达水平升高，进而诱导 U251 胶质瘤细胞阻滞，将细胞周期阻滞在某一时期，并通过 p53 途径诱导 U251 胶质瘤细胞凋亡，从而抑制脑胶质瘤细胞体外生长。Freitas等[12]近期的研究表明，芹菜素减少 GL15人胶质瘤细胞中 VEGF 及TGF-β1的含量，而作为已确认具有抑制内皮细胞增殖及血管形成作用并已上市的重组人单克隆抗体贝伐单抗，在此研究中，仅仅减少了 VEGF的含量。至于芹菜素更进一步的作用机制，该研究并未涉及。其是否通过本研究中的p53途径？芹菜素在活体研究中效果如何？这些问题都值得我们进一步研究。

本研究结果为芹菜素用于治疗胶质瘤提供了实验室依据，提示其可能为有效的胶质瘤化疗新药之一。而作为食源性提取物，芹菜素用作肿瘤临床化疗方案，与传统化疗药物相比，具有较可靠的药物安全性、较好的耐受性及较轻的毒副作用，是天然抗肿瘤药物，前景广阔，相信对其深度的药物研发，将进一步提高胶质瘤患者的生活质量，延长患者的生存时间。

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