抗生素新靶位的研究进展

李国梁，曹荣月，顾觉奋

目前临床上应用的大多数抗生素只能杀死或抑制指数方式增长的细菌，而对慢速生长的菌株没有好的效果，因而容易产生二次感染，即疾病感染的持久性。而且大多数药物是原有抗生素的衍生物，不能从根本上解决细菌的耐药性。另外，临床上许多致病菌不断表现出耐药性与多药耐药性（MDR），让临床治疗微生物感染疾病更加捉襟见肘。致病菌常见的耐药机制包括：①阻止药物进入细胞；②外排泵；③改变或修饰药物作用的靶位；④产生钝化酶；⑤形成救护机制，即形成新的代谢途径代替原来被阻断的代谢途径来合成原来的代谢产物；⑥快速增长和缓慢增长的细菌，增殖和不增殖的细菌共存。要成为一种潜在的新颖的抗生素，其作用靶位一般应具有如下特点：①靶点在真菌、细菌等微生物中广泛存在；②靶点在真核细胞中不存在，即没有毒性作用；③靶点参与真菌、细菌的致病过程；④能通过高通量筛选的方法筛选获得活性化合物；⑤不产生交叉耐药性。本综述主要对多种潜在的新颖的药物作用靶点进行介绍，希望能为新型抗生素药物的研发提供方向。

1 抗真菌药物的新作用靶点

现阶段临床上应用的抗真菌药物主要有：丙烯胺类（如特比萘芬）、多烯类（两性霉素 B 及制霉菌素）、唑类（如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等）和嘧啶类（如 5-氟胞嘧啶），它们的功能依次是作用于角鲨烯环氧化酶、真菌细胞膜、真菌细胞 P450 依赖酶以及干扰真菌核酸合成。但是这些抗真菌药都对人体产生毒副作用，比如两性霉素 B 对肾有一定的毒性，唑类药物同时作用于真菌 P450 依赖酶和哺乳动物的 P450 依赖酶，因此会对肝有一定的毒性等。新型作用靶点的研究将可以降低药物毒副作用，目前研究较为集中的有如下几点。

1.1 真菌细胞壁

细胞壁只存在于真菌细胞，哺乳动物细胞不具有，真菌细胞壁的代谢在真菌生长和分裂过程中发挥重要作用。细胞壁的功能是维持细胞内渗透压的平衡以及菌体的完整性，一旦遭破坏，菌体将溶解死亡。真菌细胞壁由几丁质、β-(1,3)-D-葡聚糖和甘露糖蛋白三种成分组成。抑制细胞壁组分的合成或破坏其结构，可以达到抑制、杀灭真菌的效果。

尼柯霉素类药物与棘白菌素类药物是典型的以真菌细胞壁为靶点的抗真菌药[1-2]。尼柯霉素类药主要抑制真菌细胞壁专有的几丁质合成酶，干扰几丁质的合成。棘白菌素类药能特异性抑制真菌细胞壁 β-(1,3)-D-葡聚糖的合成，是β-(1,3)-D-葡聚糖抑制剂。两者通过破坏真菌细胞壁的完整性与细胞内渗透压使真菌细胞溶解死亡[3]。

1.2 延长因子

延长因子是蛋白合成时需要的水溶性蛋白因子，真菌细胞延长因子主要包括：延长因子 EF-1、EF-2 和 EF-3。它们是蛋白质合成所必需的，参与 mRNA 核糖体解码和多肽合成。真菌和哺乳动物细胞中只有 EF-1 和 EF-2，并且其结构与真菌细胞 EF-1 和 EF-2 差异很大，而 EF-3 为真菌所特有（哺乳动物细胞中不存在），说明 EF-3 是抗真菌药物设计中的重要靶点。至今还没有发现选择性作用于 EF-3的化合物，这暗示选择性 EF-3 抑制剂将是一类很有潜力的广谱抗真菌药物。

目前已研发出的选择性 EF-2 抑制剂，作用于蛋白质的翻译过程，比如粪壳菌素及其衍生物，在念珠菌和新型隐球菌中抑制蛋白合成效果较好[4]。另外研究发现，新型粪壳菌素及其衍生物 GM2211676、GM2237354 和 GM2193663在小鼠网状内皮细胞真菌模型中有很好的体外抑制活性。

1.3 双组分信号转导系统

双组分信号转导系统通过影响相关基因的表达，从而间接地参与细胞生长发育与致病过程。双组分信号转导系统主要由组氨酸激酶（HK）和反应调节蛋白（RR）组成。由于只有细菌、真菌细胞编码 HK 与 RR 基因，而在哺乳动物细胞中不编码，所以双组分信号转导系统是一种潜在的新型药物靶位[5]。通过研发双组分信号转导系统抑制剂，开发出新型的药物来应对临床常见耐药菌将成为可能。

双组分信号转导系统作用过程：细胞膜的感受器激酶接收刺激信号后，自动磷酸化一个保守的组氨酸残基，然后该磷酸基转移到反应调节蛋白接受域一个保守的天冬氨酸残基上，进而活化或抑制反应调节蛋白，最后激活或抑制基因表达。

目前，双组分信号转导系统在白色念珠菌中研究比较清楚，通过基因敲除技术，HK 及 RR 的功能已基本被确定，这些双组分信号转导蛋白在菌丝-孢子形态转换、细胞适应高渗透压及氧化刺激、细胞壁生物合成以及毒力方面有着重要作用[6]。分别靶向 HK 与 RR 的药物，都能很好地抑制双组分信号转导系统功能活性。但是，靶向双组分信号转导系统中 HK 感受域由于选择性较差将被淘汰，而靶向感受器的传感域（传出信号结构）与靶向 RR 因其更加有选择性与效果而成为研究重点。

2 抗细菌药物的新作用靶点

2.1 双组分信号转导系统蛋白

双组分信号转导系统不仅存在于真菌细胞中，同时也存在于细菌细胞中，其机制与 1.3 相似。

2.2 细菌细胞分裂蛋白

细菌细胞分裂蛋白（FtsZ）是细胞分裂关键的蛋白，广泛作用于细菌的细胞分裂。当细胞分裂时，单体 FtsZ 蛋白依次连接，GTP 结合位点位于连续亚基轴连接界面，组装形成极纤维，进而在分裂位点形成与细胞质膜内表面镶嵌的Z-ring（Z 环），此环所在的平面恰好平分待分裂母细胞。在 GTP 水解供能及众多调节蛋白的作用下，Z-ring 参与DNA 的分离和细胞生长等重要生理过程[7]。因此，FtsZ 蛋白为探寻抗菌新靶位提供方向，通过抑制 FtsZ 蛋白的组装达到抗菌作用。

FtsZ 蛋白分子与真核微管蛋白有类似的结构折叠，是结构同族体。FtsZ 多聚体纤维结构，N端拥有 GTPase 活性域和核苷酸连接域，两者之间是一较长间隙（cleft），而 C 端没有特殊活性区域，部分序列可以进入 cleft，调节N 端两活性区域。而后形成的 FtsZ-ring 紧密拴住质膜内侧，经 GTP 的重复水解，为质膜收缩提供动力并顺利分裂细胞。

研究者普遍认为，配基若结合单体蛋白更趋向抑制组装，而结合多聚体上则促进组装过程。所以，可以直接以FtsZ 为靶位，如靶向 N 端的 GTPase 活性域和核苷酸连接域，从而影响或抑制组装。另外，有研究表明，单体 FtsZ中都植入了启动 FtsZ 组装的开关（switch），而 C 端序列移向 N 端并关闭两活性结构域之间的 cleft 是组装开关启动所必需的[7]。所以，寻找适合的配基，靶向此 cleft，阻止它的关闭，可达到抗菌作用。

2.3 氢化酶

氢化酶（hydrogenase）催化可逆氧化反应（H22H +2e），在微生物（古生菌与细菌）生存中起到多种作用。研究表明，H2是一种潜在的抗氧化剂，并且能特异中和 OH·（羟基自由基）。已有研究预测，OH· 是抗生素与非特异性免疫系统诱导的杀菌的主要物质[8]。除了靶点抗生素，其他主要的抗生素都能促进 G–与 G+菌产生高度有毒的OH·，最终导致细菌细胞的死亡。OH· 主要通过改变三羧酸循环（TCA）与超活化电子传递链（ETC）系统而杀菌。另外，通过（超氧阴离子）清除细菌也是非特异免疫系统抵抗病菌感染的重要机制。当细菌被相应的吞噬细胞吞没，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase）就能产生。进而破坏铁硫族，将亚铁离子进行 fenton 反应，产生 OH·，OH· 反过来损坏细菌 DNA、蛋白质与脂类，从而杀灭细菌（图 1）。但由于细菌本身氢化酶的存在，产生 H2，中和大部分 OH·，从而产生抗性。因此，靶向抑制氢化酶的生物活性分子有待发现。

2.4 维生素 H 蛋白连接酶

图1 OH· 介导细菌死亡的共同途径

维生素 H 蛋白连接酶（BPL）普遍存在于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及人体内，主要是将辅因子 biotin 连接到依赖 biotin 的酶上，从而启动相应酶的活性[9]。另外，BPL是所有 biotin 参与调节的生物事件的主要调节蛋白。如脂肪酸的生物合成是生物膜不可或缺的，而 BPL 又是脂肪酸的生物合成必不可少的。所以，在抗生素研究中，BPL 是种潜在新颖的药物靶点。

在转移辅因子 biotin 反应中，首先是 biotin 与 ATP作用产生 biotinyl-5'-AMP，然后 biotinyl-5'-AMP 将 biotin转移到依赖 biotin 的某特定赖氨酸残基上。在这过程中，biotin 主要是促进代谢产物的羧化作用。

2.5 RNA 聚合酶

细菌 RNA 聚合酶（RNA polymerase）是大部分细菌RNA 合成的关键酶，且其亚基序列高度保守而在真核RNAP I、RNAP II、RNAP III 的亚基序列中高度不保守。

Switch region，是细菌 RNAP 中一保守结构域，由switch 1～switch 5 组成。大部分的细菌都含有此结构域，并且非常保守；在转录起始时，RNAP 将 DNA 载入到RNAP 活性中心缝隙结构，在此过程中，switch region 中的五部分结构发生一系列变化，即通过调节信息交换与接触，RNAP 关闭复合物（RPc）构型转向 RNAP 开放复合物（RPo），进而启动转录。如果一些化合物与 switch region结合后，可抑制 RNAP RPc 向 Rpo 的异构化过程，使RNAP 失去活性，从而阻止转录，达到抗菌的效果[10]。所以 switch region 是一个新颖的潜在药物作用新靶位。另外，switch region 与其他抗菌剂的靶点不同，不会出现交叉耐药性，如与利福霉素结合位点不重叠。图 2A 为 RPo，B 为RPc。

2.6 RNA 降解

病原菌（G–与 G+菌）或宿主细胞 mRNA 的周转更替（即降解）过程均有特异的多蛋白复合物组成的降解体参与其中，其降解机制如图 3[11]所示。

图2 RNA 聚合酶夹与转换区构象

图3 G– 菌（A）、G+ 菌（B）与真核（C）细胞 mRNA 降解的机制

2.6.1 G–菌 mRNA 降解机制 G–菌 mRNA 降解体是多蛋白复合物，由RhlB、enolase、PNPase 和 RNase E 组成（图 3A）。RNase E 的内切作用启动 mRNA 的降解，RNase E 靶向切割 5' 端的单磷酸转录子（由三磷酸化转录子经 RppH 水解而得）；mRNA 降解依赖 RNase G、RNase P、RNase I 和 RNase III 4 种内切酶，前 3 个主要切割单链 RNA（ssRNA），而 RNase III 识别并切割双链RNA 的二级结构（dsRNA）；经 4 种内切酶酶切而得到的大片段进一步被 PNPase 或 3' → 5' 外切酶 RNase R 和RNase II 降解成更小片段；最后 3' → 5' 外切酶 Orn 则将小片段降解成单核苷酸。

2.6.2 G+菌 mRNA 降解机制 G+菌 mRNA 降解体也是多蛋白复合物，由 RNase J1、RNase J2、RNase Y、enolase、RNA helicase（CshA）、PNPase、phosphofructokinase（pfk）与 RnpA 构成（图 3B）。RNase J1 的内部切割启动 mRNA降解，RNase J1 趋向切割 5' 端的单磷酸转录子（由三磷酸化转录子经 RppH 水解而得）；其他降解体中关键内切酶有RNase J2、RNase Y、RnpA 与 RNase III，前 3 个主要切割单链 RNA（ssRNA），而 RNase III 识别并切割双链 RNA的二级结构（dsRNA）；内切酶降解所得片段进而被 3' → 5'外切酶 PNPase 与 RNase R 降解成小片段；这些小片段再由 5' → 3' 外切酶 RNase J1 彻底降解成单核苷酸。

表1 抗细菌潜在新作用靶点的作用机制及其抑制剂

2.6.3 真核细胞 mRNA 降解机制 真核细胞 mRNA 的降解由外切体介导，此外切体由 Rrp41、Rrp42、Mtr3、OIP2、Rrp46 与 PM-Sc175 依次相接而成的环状结构和 Rrp4、Rrp40 与 Cs14 构成的帽子结构两部分组成（图 3C）。另外，外切体的中心部分连接了 3' → 5' 外切酶 DIS3、PM-Sc1100 和 DIS3L（同时具有内切活性）。多聚腺苷酶水解多聚尾与 Dcp1/Dcp2 复合物或内切酶 DIS3L 脱去5' 端的帽子结构，促进 mRNA 降解起始；没帽子和尾巴的mRNA 极易被 3' → 5' 外切酶 DIS3、PM-Sc1100、DIS3L和 5' → 3' 外切酶 XRN1 或 XRN2 降解。

通过了解上述 3 种机制，再考虑每种细菌降解体中酶的保守性和同源性，经 ESKAPE 病原体核糖核酸酶实验，得到结论：G+菌的 RNase J1、G–菌的 RNase E、G+及 G–菌的 RNase P 与 RnpA 两者中的蛋白成分均是潜在的抗生素作用的新颖靶位。

2.7 rpoD 基因

rpoD（编码 RNA 聚合酶起始因子 σ）广泛存在于耐药菌与多药耐药G–菌（MDR-GNB）等细菌中，高度保守，且在真核细胞的基因没有同源序列，主要是编码 DNA 转录过程中必不可少的 σ 因子[12]。rpoD 是有义链转录所得mRNA 的一段基因序列，反义链转录的 RNA 能与之完全互补配对。所以，通过提取、人为合成一段反义寡核苷酸序列，或再将其修饰，与 rpoD 互补配对，就可达到抑制或减弱 rpoD 的表达，获得抗菌效应，即反义抗生素（反义寡核苷酸序列或其衍生物）。PPNA06 是目前发现的一种反义肽核酸复合物，即一段反义 RNA 衍生物，能与 rpoD 互补配对，能很好地减弱或抑制 rpoD 基因的表达。

2.8 核糖开关

核糖开关（riboswitches）是 mRNA 中的某区域，能依据细胞内各种代谢产物与第二信使的浓度大小调节相应基因表达；riboswitches 广泛存在于细菌中，而在真核细胞中几乎不存在；riboswitches 调控致病菌中许多重要基因，并且它的配基结合口袋拥有多种多样的识别微型分子机制[10]。Riboswitches 主要拥有适配区和表达平台两区域。通过设计微型分子与适配区结合，改变相应核苷酸序列的折叠，从而改变对应的功能活性；而表达平台则是将微型分子与适配区结合的信号传导至基因表达系统。两者协同调节相关基因的表达，通常是抑制或衰减基因的表达，从而达到抗菌作用。通过高通量筛选技术，发现了以核糖开关为靶点的几种先导化合物，如玫瑰黄色素（roseoflavin）、吡啶硫胺（pyrithiamine，PT）、L-氨乙基半胱氨酸（L-aminoethylcysteine）、DL-4-氧代赖氨酸（DL-4-oxalysine）等[13]。

2.9 NDM-1

β-内酰胺 B 类酶 NDM-1 广泛存在于超级细菌中，能分解多种 β-内酰胺类抗生素，是人类治疗超细菌感染疾病的挑战。以 NDM-1 为作用靶点，探寻抑制 NDM-1 酶活性的抗生素越来越受注视。经研究表明，NDM-1 具有多种β-内酰胺类抗生素结合域，能将 β-内酰胺类抗生素充当底物，并将其分解。这种底物结合的方式并不导致 NDM-1 的变构，即活性不改变。所以，应该寻求能与 NDM-1 以抑制剂结合的方式结合的微分子配基，并与 β-内酰胺类抗生素联合使用，达到抗菌效果。

小结抗细菌潜在新作用靶点的作用机制及其抑制剂，并归纳于表 1 中。

3 抗病毒、抗肿瘤药物作用新靶点

逆转录酶（RT）是 HIV 复制过程中不可或缺的，通过设计与 RT 结合的微型化合物，筛选能抑制 RT 活性的化合物，从而达到抗病毒的功效[8]。

HIV 复制期，逆转录酶（RT）具有两种活性：一是相当于聚合酶参与病毒 RNA 逆转录合成DNA；二是相当于核糖核酸酶降解亲代 RNA 逆转录合成的 DNA。RT 的这两种功能活性在 HIV复制期间是必不可少的。目前已知的RT 抑制剂，大多是抑制 RT 聚合活性，而不是抑制 RT 的降解活性。另外，加上 HIV 的经常性变异，RT 的 RNase H 功能区在抗病毒药物研究中将是个诱人的药物靶点。

4 结论

由于细菌表现快速增长和缓慢增长、增殖和不增殖等多种生活特性，临床上许多抗生素对真菌、细菌感染疾病的作用持续下降，并且通常存在一定的毒副作用。真菌、细菌的耐药性与抗生素功效的局限性越来越成为挑战。探索新的药物作用靶点，研制新颖的高效、安全的抗菌药物成了当今的迫切要求。可喜的是，目前该领域的研究正在持续深入，相信不久的将来会有更多高效低毒的新型抗生素问世。

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