酒曲生物转化降解河豚毒素的初步研究

贾晋斌，舒静，彭锐，孙惠川，王文权，崔安雷

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一种氨基全羟基喹唑啉化合物，通常以“两性离子”的形式存在[1]，是豚毒鱼类及其他生物体内含有的一种生物碱，也是一种剧毒的非蛋白质天然神经毒素。TTX为毒性极强的生物毒素之一，其毒性比氰化钾强1250 倍，且无有效的解毒剂[2]。河豚毒素中毒后，潜伏期短、病死率高，吸收后迅速作用于末梢神经和中枢神经系统，使神经传导障碍，首先感觉神经麻痹，后运动神经麻痹，严重的脑干麻痹导致呼吸循环衰竭[3]。

目前国内外对河豚毒素的微生物来源、性质以及河豚鱼源的河豚毒素提取和检测方面研究颇多，但微生物能否降解河豚毒素尚未见报道。在日本石川县，用河豚卵巢做的米糠浸渍酱菜，是将河豚的卵巢用盐腌藏以后，再放入米糠中让其发酵，经过盐渍一段时间后，河豚鱼的卵巢毒性可以降低到一个可供食用的水平[4]。这可能是米糠中的某些微生物作用的结果。而在白酒酿造过程中，酒曲是用高粱、玉米、大米、大麦、糯米、米粉或麸皮等粮食作物作为原料，加入一定量的母曲，在控制温度和湿度的条件下制成的，其中的微生物主要有霉菌、酵母还有少量的细菌。本研究拟在已建立的离子色谱法定量检测酒曲发酵液中的河豚毒素[5]的基础上，以酒曲为基质，利用酒曲发酵液中微生物种群这一生态体系达到转化降解河豚毒素的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培养基 黑曲霉（Aspergillus niger BYK0001008）、青霉（Penicillium BYK0001005）、黑根霉（Rhizopus nigricans BYK0001003）、酿酒酵母（S.cerevisiae BYK00049-01-01）、乳酸菌（Lactobacillus BYK00056-01-01）取自农业部渔业动植物病原库。PDA 培养基和 MRS 培养基，用0.1 MPa 压力灭菌 20 min。

1.1.2 仪器、试剂及材料 GSP-9270MBE 隔水式恒温培养箱为上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；GHP-9050 隔水式恒温培养箱为上海一恒科技有限公司产品；DL-5-B 型低速离心机为上海安亭科学仪器厂产品。实验用水为 Millipore Advantage A10 超纯水；浓硫酸、磷酸为分析纯，购自国药集团；TTX 标准品（纯度 ≥ 99%）购自河北省水产研究所；酒曲为山东黄河龙酒业集团股份有限公司提供。

1.1.3 实验动物 普通级昆明小鼠，雄性，30 ～32 g，购自上海实验动物资源中心。

1.2 方法

1.2.1 TTX 溶液的配制 1 mg TTX 标准品溶于10 ml 0.1% 的磷酸溶液中，制成 100 mg/L 的溶液，依次稀释成 40、60、80、100 mg/L 的 TTX溶液。

1.2.2 配制指示菌悬液 将三种霉菌（黑曲霉、青霉、根霉）制成一定浓度的稀释液：将 121 ℃ 灭菌 20 min 的无菌水加入到培养有霉菌斜面的试管中，用接种环轻轻刮下孢子，将含有孢子的无菌水转入三角瓶中，加入玻璃珠，在摇床上打碎，经滤膜过滤后得到单孢子悬液 10 ml。酿酒酵母和乳酸菌[6]分别在 PDA 液体培养基和 MRS 液体培养基中培养 3 d 后，分别用无菌吸管从三角瓶中吸取1 ml 孢子液注入盛有 9 ml 无菌水的试管中，以此类推，制成 10-2、10-3、10-4、10-5稀释度的菌悬液。

1.2.3 抑菌实验方法[7]将 PDA 固体培养基和MRS 固体培养基在高压灭菌釜中，用 0.1 MPa 压力灭菌 20 min，并冷却至 60 ℃ 左右，用吸管准确量取 20 ml，加入内径一致并预先水平放置的培养皿内，凝固后干燥培养皿中水份，吸取一定浓度的指示菌悬液 0.3 ml 至平板上，用无菌玻耙涂布均匀，涂布后以平板无可见水滴为准，并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，在水平放置的平皿中均匀地放置 4 只牛津杯。吸取一定浓度的TTX 溶液 0.25 ml 至上述牛津杯中，注意不要将TTX 溶液溢出牛津杯外。将陶瓦盖盖在加入 TTX溶液的平皿上，然后将其放置在 35 ℃ 的恒温培养箱中培养 5 d 后拍照。

1.2.4 转化条件优化实验

1.2.4.1 培养时间对转化速率的影响 称取 30 g酒曲于三角瓶中，添加 1 ml 上述配制好的 100 mg/L TTX 溶液，搅拌均匀，分别称重，记录。置于30 ℃ 恒温培养箱中培养，每隔 48 h 依次取样一次，称重，及时添加去离子水以补充在培养过程中蒸发的水分。在培养过程中，每天早晚都予以搅拌。取好的样品置于 –18 ℃ 冰箱中保存。

1.2.4.2 酒曲投加量对转化速率的影响 分别往10、20、30、40、50、60 g 酒曲中添加 1 ml 100 mg/L的 TTX 溶液，搅拌均匀，置于 30 ℃ 恒温培养箱中静置培养，48 h 后取样测发酵液中 TTX 的浓度。TTX 的转化速率 =（TTX 的初始浓度 － 转化后 TTX 的浓度）/时间。

1.2.4.3 温度对转化速率的影响 将酒曲发酵液中加入 1 ml 100 mg/L 的 TTX 溶液，搅拌均匀，分别置于 20、25、30、35、40 ℃ 恒温培养箱中恒温培养，48 h 后取样测发酵液中 TTX 的浓度。

1.2.4.4 摇床转速对转化速率的影响 将酒曲发酵液中加入 1 ml 100 mg/L 的 TTX 溶液，搅拌均匀，静置，30、50、100、150 r/min 摇床培养箱中30 ℃ 恒温培养，48 h 后取样测发酵液中 TTX 的浓度。

1.2.5 小鼠法检测转化效果 在上述确定的最佳转化条件下，用小鼠法[8-9]检测酒曲发酵液对 TTX的转化效果。以注射器中样液全部注入小鼠体内开始计时，以出现河豚毒素中毒的典型症状为标准判断小鼠是否为中毒致死，以小鼠停止呼吸为判断时间终点的标准。小鼠中毒的典型症状是注射后先安静，随后急动、转圈、动作生硬不灵活、大口呼吸、抽搐，最终死亡。

1.2.5.1 样品处理 称取 40 g 酒曲于三角瓶中，分别添加 1 ml 100 mg/L 和 10 mg/L 的 TTX 溶液，搅拌均匀，置于 30 ℃，转速为 50 r/min 的培养箱中摇床培养，每隔 48 h 取样一次，分别标号。样品中加 0.1% 磷酸乙腈溶液，5000 r/min 离心10 min，取上清液，50 ℃ 减压蒸馏除去乙腈，用0.1% 的磷酸溶液溶解定容至 1 ml。

1.2.5.2 小鼠法检测条件 把 TTX 标准品用乙酸溶解为 1 mg/L，不断稀释，取 0.3 ml 腹腔注射小鼠，至小鼠死亡时间接近 30 min，当稀释至浓度为 0.1 mg/L 的 TTX 标准品溶液注射小鼠时，小鼠未死亡。样品中的 TTX 提取出来后，取 0.3 ml注射小鼠，每个样重复 3 次，取平均死亡时间。

2 结果

2.1 抑菌实验确定 TTX 初始浓度

从图 1 中可以看出，对于各种稀释度的指示菌悬液，在 4 种浓度的 TTX 溶液作用下，均无明显抑菌圈出现，说明 100 mg/L 以内的 TTX 浓度对酒曲中的微生物没有影响。

2.2 条件优化

2.2.1 培养时间的影响 利用离子检测方法对每隔 48 h 取样酒曲样品进行测定，发现经过一段时间，河豚毒素的含量发生了很大变化，图 2 为添加到酒曲发酵液中的 TTX 含量随培养时间变化的趋势图。

由图 2 可见，随着时间的增加，酒曲的毒素转化率也随之增加，当培养时间为 6 d 时，酒曲的毒素转化率最高，毒素转化率达到 80% 以上，随着培养时间的继续增加，酒曲中开始出现杂菌生长，且有不良气味散出，不宜再继续转化实验。

图1 不同浓度的 TTX 溶液对几种微生物的抑菌效果Figure1 Antibacterial activity of different concentrations of TTX solution to several microorganisms

图2 酒曲中 TTX 含量随时间变化趋势Figure2 Trends over time of TTX content in distiller's yeast

2.2.2 酒曲投加量的影响 由图 3 可以看出，随着酒曲投加量的增加，TTX 的转化速率也随之增加，直到投加量为 40 g 时 TTX 的转化速率最高，转化率达到了 76.8%，当投加量超过 40 g 时，酒曲对 TTX 的转化速率基本维持不变。

2.2.3 培养温度的影响 不同温度下，培养 2 d后酒曲在 30～35 ℃ 对 TTX 的降解效果最为显著，达到 90% 以上（图 4）。

2.2.4 摇床转速的影响 在实验中，由于酒曲是半固体状态，采用摇床振荡培养来考察通气量对TTX 转化速率的影响。结果（图 5）表明，一定的通气量对 TTX 的转化有一定促进作用。静置培养或摇床转速过大均不利于酒曲对 TTX 的转化。当转速达 50 r/min 时可获得最佳的转化效果。

图3 不同酒曲投加量对 TTX 转化速率的影响Figure3 Influence of different distiller's yeast dosage to TTX transformation rate

图4 不同温度下对 TTX 转化速率的影响Figure4 Influence of different temperature to TTX transformation rate

图5 不同摇床转速对 TTX 转化速率的影响Figure5 Influence of different shaker rotate speed to TTX transformation rate

2.3 小鼠法检测结果

小鼠生物法检测 TTX 转化效果如表 1 所示。

由于添加到酒曲中的 TTX 初始浓度很大，为100 mg/L，小鼠被注射后在很短的时间内死亡，表明酒曲中的河豚毒素浓度很大，未能将其降到安全浓度以下。TTX 初始浓度为 10 mg/L时，与第 2 天相比，第 6 天的小鼠死亡时间已由 1.5 min 延长为 20 min，虽然对小鼠的毒性仍较大，但可以看到酒曲对 TTX 的转化有明显效果。

表1 小鼠生物法测定酒曲对 TTX 转化效果Table1 Effect of distiller's yeast on TTX transformation by mouse bioassay

3 讨论

由于自然界河豚鱼含毒各器官中 TTX 平均浓度约为 100 mg/L。进行抑菌试验的目的是为了检测在自然界河豚鱼器官中平均浓度的 TTX 溶液对酒曲中的微生物的生长抑制作用及程度，以此来判断酒曲中添加 TTX 的浓度。

酒曲对河豚毒素的转化实验结果表明，经过一段时间的作用，添加到酒曲中的 TTX 含量在减少，酒曲对河豚毒素确实有一定的转化降解作用。对影响转化降解的因素，如时间、酒曲投加量、温度、摇床转速等进行了初步探索，找出了最佳的转化降解条件。生物转化过程中，微生物量对于 TTX的转化时间有着重要的指导意义。本实验中，微生物浓度越低，达到一定处理效果所需时间越长，而微生物浓度过高，由于受到包括溶氧量等其他条件的限制，化合物转化速率不再上升。且温度对微生物具有广泛的影响，总体上说，微生物的全部转化过程都取决于化学反应，反应速率都受温度的影响，在最适生长温度范围内，反应温度升高，平均转化速率随之增加，但超过一定限度，会使酶失活速率也加快。

有关转化机理以及 TTX 被转化为何种物质，有待于进一步研究确定。微生物转化的本质是某种微生物将一种物质（底物）转化成为另一种物质（产物）的过程，是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用微生物代谢过程产生的某个或某一系列的酶对底物特定基团进行的催化反应[10]。一般的微生物对有机化合物的转化模式，主要有以下几种：脱氢反应（主要是细菌）、羟基化反应（主要是放线菌）、水解反应（主要是细菌、霉菌、酵母菌）、还原反应（主要是酵母菌和霉菌）、酰基化反应（主要是细菌）、降解反应（主要是细菌）、脱水反应（主要是细菌和霉菌）等。河豚毒素有多种衍生物：脱水河豚毒素、河豚酸、4-表河豚毒素、6-表河豚毒素、4-表-11-脱氧河豚毒素、4,9-脱水-6-表河豚毒素、11-Nor-河豚毒素-6 (R)-ol、11-脱水河豚毒素和 5-脱氧河豚毒素等[11]，但毒性都没有河豚毒素那么强。无毒的河豚鱼体内含有河豚毒素衍生物，其对小鼠没有致死性，表明该河豚鱼是以无毒的河豚毒素衍生物作为前体或代谢产物[12]。

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